Samenvatting

Samenvatting
Reumatoïde artritis (RA) is een ziekte die gekenmerkt wordt door chronische
gewrichtsontsteking. Dit leidt tot gewrichtspijn en zwelling en zal, indien onbehandeld, ernstige
gewrichtsschade veroorzaken. Bij patiënten met RA ontstaat een ontstekingsinfiltraat in het
synovium, het weefsel dat de gewrichten omkleed. In dit ontstekingsinfiltraat wordt een grote
variëteit cellen aangetroffen: dendritische cellen, T – en B lymfocyten, plasmacellen,
macrofagen, fibroblastachtige synoviocyten en andere. Hoewel al deze cellen en hun cytokinen
een rol spelen in het ontstaan en men name in het persisteren van de gewrichtsontsteking, wordt
met name aan T lymfocyten een belangrijke rol toegeschreven.
T lymfocyten die we in het synovium terugvinden, onderscheiden zich van “normale” T
lymfocyten in het bloed van reumapatiënten of gezonde mensen. Eén van de bijzondere
eigenschappen van synoviale T cellen is dat ze veel minder gevoelig zijn ten aanzien van externe
prikkels, ofwel “hyporesponsief” zijn. Een tweede bijzondere eigenschap is dat ze lijden aan wat
“oxidatieve stress” genoemd wordt. Van oxidatieve stress wordt gesproken wanneer een cel in
contact komt met meer zuurstofradicalen dan de normale cellulaire buffercapaciteit (bestaande
uit alle anti-oxidanten) kan verwerken. Recent werd gevonden dat bij reumatoïde artritis de
oxidatieve stress waaraan synoviale T cellen lijden, lijkt samen te hangen met hun
ongevoeligheid op externe prikkels. Behandeling van synoviale T cellen in kweek met
antioxidanten, deed deze ongevoeligheid afnemen, terwijl T cellen van gezonde donoren na
blootstelling aan oxidatieve stress even zo ongevoelig voor externe prikkels werden als synoviale
T cellen.
Algeheel wordt aangenomen dat de oxidatieve stress bij synoviale T cellen ontstaat door
langdurige blootstelling aan een overmaat zuurstofradicalen uit hun directe omgeving.
Zuurstofradicalen vinden echter niet noodzakelijk hun oorsprong in de directe omgeving waarin
een cel zich bevindt. Een cel zelf maakt ook zuurstofradicalen aan, meestal als bijproduct van
ons normale metabolisme. Zo ontstaan in de mitochondriën zuurstofradicalen als bijproduct van
ons aëroob metabolisme waarin zuurstof wordt omgezet tot energie in de vorm van ATP. Bij
activiteit van verscheidene enzymen die toxische stoffen afbreken zoals peroxisomen,
cytochroom P450, en xanthine oxidase ontstaan eveneens zuurstofradicalen als nevenproduct.
Zuurstofradicalen kunnen echter ook intracellulair ontstaan na stimulatie van specifieke
cellulaire oppervlaktereceptoren. Waar alle boven vermeldde zuurstofradicalen gezien worden
als schadelijke afbraakproducten, zijn er sterke aanwijzingen dat de zuurstofradicalen die
intracellulair geproduceerd worden na receptorstimulatie een eigen specifieke functie hebben in
het doorgeven van de extern stimulus naar specifieke intracellulaire targets. Zo wordt
bijvoorbeeld NF-κB door zuurstofradicalen geactiveerd. NF-κB is een transcriptiefactor die
verantwoordelijk is voor de activatie van diverse pro-inflammatoitre genen, waaronder TNF-α,
die een centrale rol spelen bij RA.
In dit proefschrift wordt daarom het onderzoek beschreven naar de oorsprong en de gevolgen
van de oxidatieve stress in synoviale T cellen. Tevens wordt het resultaat beschreven van
therapieën, die gericht zijn op het opheffen van deze oxidatieve stress. Zowel een oraal
voedingssupplement dat de meeste anti-oxidanten bevat, als intraveneuze therapie met hoge
dosis N-acetyl cysteïne, het sterkste antioxidant.
108
Hoofdstuk 1 is een introductie hoe zuurstofradicalen ontstaan en geeft een gedetailleerd
overzicht van studies naar de mogelijke rol van zuurstofradicalen als signaaltransmissie. Welke
celreceptoren tot zuurstofradicaal productie lijden, welke enzymen betrokken zijn en welke de
downstream effectormoleculen voor de zuurstofradicalen kunnen zijn.
In hoofdstuk 2 beschrijven we de ontwikkeling van een nieuwe techniek die het toelaat
rechtstreeks de productie van zuurstofradicalen te meten en deze productie in het synoviaal
weefsel te visualiseren. Door gebruik te maken van deze techniek tonen we aan dat de oxidatieve
stress in de synoviale T cellen bij RA patiënten niet veroorzaakt wordt door chronische
blootstelling aan zuurstofradicalen in hun omgeving, maar dat de overmaat aan zuurstofradicalen
geproduceerd wordt door intracellulaire enzymen. Bovendien kunnen we door toevoeging van
verschillende enzyminhibitoren aantonen dat het geproduceerde zuurstofradicaal waarschijnlijk
waterstofperoxide (H2O2) is.
In hoofdstuk 3 onderzoeken we hoe het enzym dat de intracellulaire zuurstofradicalen genereert,
geactiveerd wordt. We tonen aan dat er een signaalroute in T lymfocyten bestaat, dat bij activatie
leidt tot intracellulaire zuurstofradicaal productie. Deze route wordt gecontroleerd door 2 vitale
eiwitjes: Ras en Rap1, die beide behoren tot de groep van kleine GTPase eiwitten. Waar activatie
van Ras lijdt tot productie van zuurstofradicalen, zal activatie van Rap1 lijden tot blokkade van
deze zuurstofradicaal productie. In de synoviale T cellen vinden we dat het Ras eiwit constant
geactiveerd is, terwijl zijn tegenpool Rap1 juist niet kan geactiveerd worden. Dit lijdt tot de
continue overmatige productie van de intracellulaire zuurstofradicalen. Introductie van een
dominant negatief Ras in synoviale T cellen kan deze zuurstofradicaalproductie opheffen.
Hoofdstuk 4 gaat verder in op de activatie van het Ras eiwit en de blokkade van het Rap1 eiwit.
We laten zien dat activatie van Ras kan voortkomen na diverse stimuli, met name na chronische
stimulatie van verschillende cytokinen waaronder TNF-α. Belangrijker echter is dat we vinden
dat de inactivatie van Rap1 in synoviale T cellen ontstaat na cel-cel contact tussen de T lymfocyt
en een macrofaag uit het synovium. Bovendien worden sterke aanwijzingen gevonden dat dit
proces loopt via activatie van de CD28 co-receptor op het T cel membraan. Niet alleen
experimenten waarin het cel-cel contact tussen macrofaag en T lymfocyt wordt verbroken lijden
tot afwezigheid Rap1 inactivatie, ook toevoeging van CTLA4, de natuurlijke antagonist van de
CD28 receptor, blokkeert de inactivatie van Rap1. Ook wordt in hoofdstuk 4 nogmaals
aangetoond hoe cruciaal de inactivatie van Rap1 is in de productie van zuurstofradicalen.
Parallel aan Rap1 inactivatie vinden we de toegenomen intracellulaire zuurstofradaalproductie,
en terzelfder tijd de “hyporesponsiviteit “ van T lymfocyten ontstaan.
Hoofdstuk 5 geeft de resultaten van een dubbelblind uitgevoerde trial waaraan 66 patiënten met
actieve RA deelnamen en waarin het effect wordt nagegaan van een dagelijks
voedingssupplement waarin naast alle genoegzame anti-oxidanten ook de ω-3
(eicosapentaeenzuur (EPA) en docosahexaeenzuur (DHA0) en ω-6 (gamma-linoleenzuur (GLA))
polyonverzadigde vetzuren zaten. Hoewel RA patiënten zich enthousiast uitten ten aanzien van
voedingssupplementen en we significante toename zagen van de serumconcentraties vitamine E,
EPA en DHA, werd geen klinisch significant benificieel effect gevonden ten aanzien van een
placebo groep.
Hoofdstuk 6 beschrijft de resultaten van een studie waarin 14 patiënten met actieve RA werden
behandeld met hoge dosis van het sterke antioxidant NAC, dat werd toegediend via een continu
infuus gedurende 24 uur. Ook hier werd geen belangrijke klinische verbetering van de RA
activiteit gevonden. En hoewel de synoviale T cel responsiviteit zich na het NAC infuus zich
lijkt te herstellen, vonden we geen herstel van andere cruciale signaaleiwitten (zoals Linker for
activation of T cells (LAT) dislocatie, of NFκB inactivatie). Tot slot werden ook in deze setting
opnieuw sterke aanwijzingen gevonden dat zuurstofradicalen een cruciale rol kunnen spelen in
cellulaire signaaltransductie en dat de belangrijke pro-inflammatoire transcriptiefactor NFκB
gereguleerd zou kunnen worden door de productie van intracellulaire zuurstofradicalen en de
109
cellulaire redoxbalans: in dezelfde synoviale T cellen die de kenmerken dragen van ernstige
oxidatieve stress (dislocatie van LAT uit celmembraan), vinden we activatie van het centrale
pro-inflammatoire transcriptiefactor NFκB.
Samenvattend draagt dit proefschrift bij tot het bewijs dat vrije radicalen meer zijn dan alleen
maar afbraakproducten van ons aëroob metabolisme of toxische stofjes uit ons milieu. Wij
hebben bewezen dat in normale T lymfocyten een mechanisme bestaat dat op specifieke externe
prikkels een kleine hoeveelheid zuurstofradicalen doet produceren in het cytoplasma van deze
cellen. Deze zuurstofradicalen zijn essentieel voor een normale respons van de cel, en spelen een
rol in de activatie van specifieke genen. Aanvullend toonden wij aan dat bij patiënten met
reumatoïde artritis de productie van zuurstofradicalen in de T lymfocyten volledig ontregeld is.
Waar “gezonde” T lymfocyten slechts een zeer kleine hoeveelheid zuurstofradicalen aanmaakt,
produceert de T lymfocyt in ontstoken gewrichten een overmaat aan zuurstofradicalen. Hierdoor
raakt de T lymfocyt volledig ontregeld. Niet allen reageert de cel verschillend op externe
prikkels, de cel maakt hierdoor een overmaat aan ontstekingsbevorderende eiwitten.
Echter, behandeling met anti-oxidanten leverde bij onze patiënten met actieve reumatoïde artritis
geen significante verbetering op van hun ziekteactiviteit.
110