University of Groningen Direct gene transfer to plant

University of Groningen
Direct gene transfer to plant protoplasts, basic aspects and application
Steege, Gerrit van der
IMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to
cite from it. Please check the document version below.
Document Version
Publisher's PDF, also known as Version of record
Publication date:
1991
Link to publication in University of Groningen/UMCG research database
Citation for published version (APA):
Steege, G. V. D. (1991). Direct gene transfer to plant protoplasts, basic aspects and application s.n.
Copyright
Other than for strictly personal use, it is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the
author(s) and/or copyright holder(s), unless the work is under an open content license (like Creative Commons).
Take-down policy
If you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediately
and investigate your claim.
Downloaded from the University of Groningen/UMCG research database (Pure): http://www.rug.nl/research/portal. For technical reasons the
number of authors shown on this cover page is limited to 10 maximum.
Download date: 18-07-2017
CHAPTERVIII
SAMENVATTING
Directe gen overdíacht, direct gene
transÍer(DGT),naar gersoleerdeplantecellen
(protoplasten),
zonderbiologische
vectoÍ(e.9.
bacterieoÍ virus)als intermediaií,
wordt in het
planten-onderzoekhooÍdzakelijk gebruikt
vooÍ twee doeleinden: de oroductie van
plantenoÍ weeísels
stabielgetransÍormeerde
en het meten van transiënteexpressievan,
veelal chimaera, genen. Men spreekt van
stabieletransÍormatie,
wanneeíhet exogene
DNA geïntegreerd raakt in het gastheer
genoom en stabiel aanwezig blijÍt. Exogeen
DNAkan na opnamein de protoplasten
extÍachromosomaaltot expÍessie komen; deze
expressieheeft een tijdelijk karakteÍen wordt
daaromtransiënteexpressiegenoemd.
In beide gevallenworden DNA moleculen,
meestalbacteriëleplasmidenmet daaÍop de
gewenste genen, ingebracht in zoveel
mogelijk protoplasten. Opname kan
bewerkstelligdworden door de protoplastmembranen doorlaatbaaÍ te maken met
chemicalién (bijvoorbeeld poly-ethyleen
glycol, PEG) of met elektÍische velden
(electroporatie). Integratie van
het
opgenomen gen in het protoplastgenoom
vindt niet in iederebehandeldecel olaatsen
bovendienniet altijdop een dusdanigeplaats
in het genoom,waar het in voldoendemate
tot expressiekomt. Deze lage Írequentievan
stabieletransÍormatiemaakt het gebruikvan
selecteeÍbaregenen praktisch noodzakelijk
bii dit soort experimenten.Produktievan
stabieletransíoímantenkan, als praktische
toepassing,leiden tot de ontwikkelingvan
planten met nieuwe eigenschappen,die
bijvoorbeeld een verhoogde produktie oÍ
gevolg hebben.
ziekte-resistentie tot
Anderzijds kunnen stabiele transfoÍmanten
gebruiktworden voor moleculairbiologische
experimenten, bijvoorbeeld voor
de
bestuderingvan de Íunctie en Íegulatievan
genen. Echter, het expÍessienivo van het
ingebrachtegen is aÍhankelijkvan de plaats
op het genoom,waaÍ het geintegreerd
is. Dit
bemoeilijkthet trekken van conclusies uit
experimentenwaarbij expressienivo's van
verschillende gen-constÍucten veígeleken
worden. Grote groepen individuelestabiele
transÍormantendienen gegeneÍeerden geanalyseerd te worden om conclusies te
/Á^hfir..r.li^ên
Voor het metenvan transiénteexpressieis
van het gen-produkt
de detecteerbaarheid
van het ingebrachtegen van belang. Het
grote voordeelvan het meten van tÍansiénte
expressieten opzichte van het maken van
stabiele transÍoímantenvoor gen-expressie
studies is het enorme verschil in tijd-stip,
waarop de resultatenvan de experimenten
geanalyseerdkunnen worden. Terwijl het
selecterenen regenererenvan een stabiele
transÍormant, zelÍs vooÍ de "snelleÍe"
plantensoorten
en tíansÍormatie
methoden,al
gauw een paar weken duurt en met een
protoplastals uitgangspuntzelfs maanden,
kan het resultaat van transiënte exoressie
reeds 1 à 2 dagen na DNA-opnamegemeten
worden. Bovendienwordt bij het meten van
gemiddelde
tíansiënte expressie het
expressienivo bepaald in een groot aantal
cellen, waaÍdoor vergelijkingen gemaakt
kunnen worden tussen verschillendeoenconstructen.
Dit proeíschrift beschrijft onderzoek,
waarinde DNA overdrachtnaar pÍotoplasten,
hoofdzakeliikvia electÍoporatie,bestudeerd
werd.Ruwwegkan het beschreven
onderzoek
in tweegedeeltenwoÍdengesplitst.Het eerste
gedeelte (Hoofdstukkenll, lll en lV) beslaat
onderzoeknaar het tÍansÍormatieproces op
zich en de reactievan pÍotoplastenop de
opname van DNA. In het tweede gedeelte
(Hoofdstukken Vl en Vll) wordt de
toepasbaarheid
van het metenvan transiënte
expressieonderzochten geillustreerdaan de
hand van analyse van expressie van het Bglucuronidase (GUS) Íeportergen onder
transcriptionele
controlevan (gedeeltenvan)
de promotoÍvan het korrelgebonden
zetmeelsynthasegen uit aardappel.
90
ln Hoofdstuk I wordt eeÍst een korte
inleiding gegeven oveÍ transÍoÍmatievan
protoplastenom vervolgensuitgebreider
in te
gaan op een aantal stappen in het
tíansÍormatie proces: a) de DNA overdracht
naar píotoplasten,d.w.z.de passagevan de
pÍotoplastmembraan;b) de detectievan de
transfoímatie,d.w.z. de diverse merker-en
Íeporter-gen systemen, die recentelijk
ontwikkeldzijn; en c) de expressievan het
opgenomen DNA: aandacht woÍdt besteed
aan Íactoren,die het transiënteexpressienivo
kunnenbeïnvloeden.
De methodevan DGT,zoalsdie tijdensde
ondeÍzoek-oeÍiodeontwikkeld is voor o.a
aardappelsuspensieprotoplasten
met behulp
van electroporatieen het GUS reporteÍgen,
staat beschíevenin HooÍdstukll.
Een lastig punt bij het vergelijkenvan
electroporatie experimenten, beschíeven in
de literatuur, is het íeit dat de resultaten
verkregen zijn met verschillendeappaÍatuuí
en met verschillende
vormen van elektrische
velden.Het gebruikvan zowel (meervoudige)
korte blok-pulsen,zoals toegepast bij het
electroÍusie proces, als wel van langere,
exponentieelaïnemende pulsen (ontlading
van een condensator)kan leidentot meetbaÍe
tíansiénteexoressie.ln HooÍdstuklll is de
invloed van elektrische velden op de
protoplast membraan nader bestudeerdmet
behulp van zowel DNA-electroporatieals
electroíusieexpeíimenten.Bij Íusie van de
protoplasten,veÍoorzaakÍdooí een korteblokpuls met een hoge spanning(toegediendna
oplijnen van de protoplasten in een
wisselspanningsveld),
bleek een kritische
puls-spanningnodig te zijn om Íusie te
veroorzaken. Bij hogere voltages werden
respectabele (>50%) fusie peícentages
gevonden.DNA opname na toedieningvan
dezê "Íusie"-pulsenwas echter niet erg
e f Í e c t i e.f
De
langere, exponentieel
aÍnemende, eleklrische velden, alsmede
complexepulsen,bestaandeuit een hoge en
een, langere, lage spanning-component,
bleken etfectiever. Het fusie-gedrag van
píotoplastenbleek wel een voorspellende
waardete kunnenhebbenvoor de elektrische
CHAPTERVIII
parameters, nodig vooí effectieve DNAopname.
De mate van transiênte expressie en de
Íreouentievan stabieletransÍormantieis tot
op zekere hoogte afhankelijk van de
hoeveelheid opgenomen DNA. Echter,
wanneerhet DNA eenmaalis opgenomenin
de píotoplasten, betekent dit niet, dat
automatischhóge tíansiënteexpressienivo's
gÍóte aantallen stabiele
bereikt, oí
tÍansÍoímanten geproduceerd kunnen
worden. Protoolasten van verschillende
planten,ook al behoÍenze tot dezelfdesoort,
kunnenverschillenin hun "competentie"om
op exogeen DNA te reageÍen.HoofdstuklV
behandelt expeÍimenten, waarin getÍacht
(verschillende) Íeactie van
weíd de
pÍotoplastenop de opname van DNA te
onderzoeken.Een eerste gedachte, dat de
mate van nuclease aanwezigheid (een DNA
afbÍekendewerking, tevens ooízaak van het
tijdelijke karaktervan transiënteexpressie)in
de píotoplasten,het nivo van expressie
bepaalt,bleek niet op te gaan. Aanwijzingen
werden gevonden, dat verschillen in de
hoeveelheidaanwezige nuclease activiteit
tussen de diverse soorten protoplasten
positieÍnoch negatieÍcorreleerdenmet het
nivo van tÍansiënteexpíessie.Tevensbleek,
dat met het gebÍuikte electÍoporatiesysteem
de omstandighedenwaaronder maximale
transiënte expressie werd bereikt, gÍote
gevolgen had vooÍ het overlevingspeÍcentagevan de protoplasten.Vaak ging
een overlevingvan 2O7"oÍ lager gepaard met
de hoogste expressie in het betreffende
experiment. Dit hoge sterfte cijfer van de
protoplastenbleek niet zozeerhet gevolg te
zijn van de elektrischebehandeling,als wel
van de opname van DNA of de combinatie
van beide. Ondankslage overlevingvan dê
protoplastenen een snelle aÍbraak van het
opgenomenDNA kunnenblijkbaarzeer goed
transiënte expressie experimentengedaan
worden. Uit een aantal expeÍimentenbleek,
dat veelanderemodiÍicaties
ootredenaan het
aangebodenDNA.Ligatievan lineairestukken
DNA bleek een proces, dat veelvuldig
CHAPTERVIII
nodig vooÍ effectieve DNA-
van transiënteexpressieen de
ln stabieletÍansformantieis tot
hoogte aÍhankelijk van de
opgenomen DNA. Echter,
DNAeenmaalis opgenomenin
sten, betekent dit niet, dat
hógetransiénteexpressienivo's
gÍóte aantallen stabiele
geproduceerd kunnen
9n
otoplasten van verschillende
al behorenze lot dezelfdesoon,
rhillenin hun "competentie'om
DNA te reageren.HooÍdstuk lV
xpenmenten, waaÍin getracht
(verschillende) reactie van
op de opname van DNA te
Een eeÍste gedachte, dat de
oleaseaanwezigheid(een DNA
eÍking,tevensoorzaakvan het
der van líansiënteexpressie)in
ten, het nivo van expÍesste
í niet op te gaan. Aanwijzingen
nden, dat verschillenin oe
aanwezige nuclease activiteit
Civerse soorten protoplasten
negatiefcorreleerdenmet nel
;iënteexpressie.Tevens bleek,
ebruikteelectroporatiesysteem
;heden waaronder maximale
pressie werd bereikt, gÍote
td voor het overlevingsn de protoplasten.
Vaak ging
van20%oÍ lagergepaard met
:xpressie in het betreffenoe
it hoge slerfte cijíer van de
leekniet zozeerhet gevolg te
:ktrischebehandeling,
als wer
re van DNA oÍ de combinarre
dankslage oveÍlevingvan de
n een snelleaÍbraakvan het
,lAkunnenblijkbaarzeer goed
ressie experimenten gedaan
n aantalexperimentenbleek,
modiíicaties
optredenaan het
,lA.Ligatievan lineairestukken
en proces, dat veelvuldio
CHAPTERVIII
voorkwam. Opvallend was o.a., dat
electropoÍatie van twee gelineaÍiseeÍde
plasmiden,met op het ene molecule het
rêpoÍteÍgenen op hei anderede benodigde
píomotor,resulteeÍdein transiënteexpressie
tot 20-30%van het nivo bereiktmet een intact
chimeer construct.Het transÍormatiesysteem
en het gebruik van protoplastenwoíden kort
geëvalueerdin HooídstukV.
HoofdstukkenVl en Vll gaan in op het
gebruik van transiënteexpressiemetingen
om het íunctioneíen en de regulatie te
bestuderenvan het korrelgebonden
zetmeelsynthasegen uit aardappel.Dit gen (GranuleBound
Starch Synthase, GBSS) is
veÍantwooídelijk voor de produktie van
amylose, een component van zetmeel.
Promotor Íragmenten van dit gen werden
gekoppeld aan het GUS reportergen.
HoofdstukVl bespreektkarakterisering
van de
stíuctuuÍ van de GBSS oromotoÍ via
tíansiénte expressie metingen, uitgevoeÍd
met chimaera constíucten in suspensie
pÍotoplastenvan 3 aardappelcellijnenen een
wortel lijn. Het GUS gen bleek goed tot
expressiete komen onder invloedvan GBSS
promotor sequenties.Tevens konden met
behulp van transiénteexpressieexperimenten
duidelijkeverschillenin activiteittussen de
diverse constructengemeten worden. O.a.
bleek de oromotoractiviteitvan een 0.4 kb
fÍagment groter te zijn dan die van een
fÍagmentvan 0.8 kb.
HooÍdstukVll beschrijftonderzoeknaar
gereguleerdetransiënte expressie van de
GBSS-GUS chimaera genen. Transiënte
expressieweÍd gemetenin blad-protoplasten
van diverse soorten olanten. Met name in
aardappelprotoplastenbleek het expressie
nivo in blad pÍotoplastenbeduidend lager
dan in, ongedifÍerentieerde,suspensie
pÍotoplasten. lncubatie van suspensie
protoplastenin licht, na transÍectiemet DNA,
bleek een remmendewerkingte hebbenop
tÍansiënte GBSS-GUS expressie; dit in
tegenstellingtot blad protoplasten,Analyse
van stabiele tÍansÍoÍmantentoonde aan, dat
een GBSS píomotoÍ íragment van 0.4 kb
YI
voldoendewas vooÍ weefsel-aÍhankelijke
GUS
expressie:zowelvoor de 0.4 kb als de 0.8 kb
GBSS promotor kon, vergeleken met
expressie in blad, tot een 1500-voudige
verhogingvan GUSactiviteitgemetenworden
in geïnduceerde microknollen. Transiënte
exoressie van de GBSS constructen kon
gedurende
verhoogdwordendoor suspensies
lange tijd te kweken bij hogere sucíose
concentraties.
Het gebruik van pÍotoplastenvooí de
produktie van stabiele tÍansÍormantenzal,
vooral met de opkomst van nieuwere DGT
techniekenals de "particlegun",waarschijnlijk
mindeÍ belangrijkworden. Echter,met name
de experimentenuit de HooÍdstukkenVl en
Vll tonen de waarde van tÍansÍormatievan
protoplastenen het volgen van transiênte
expressievan ingebrachtegen-constructen
vooí moleculair genetisch onderzoek.
gen-expressie
Wanneer weeÍsel-aÍhankelijke
bestudeeÍdwoídt, met behulp van chimaera
genen, dan ligt de noodzaak van het
genereÍenvan stabieletransfoÍmantenvooÍ
de hand. Verschillenin expressieniveaus,
gemeten in diverse weefsels van een
tÍansgene plant,
kunnen
informatie
verschatÍenover de werkino en reoulatievan
een planten-gen.
Echter,wanneerde sterktevan een promotor
of de verschillende activiteit van meerdere
promotorÍragmentenbepaald moet woíden,
dan zijn tíansiënteexpressieexpeíimenten
zeeí nuttig.Het feit dat een gevondenwaaíde
voor transiênte expressie de gemiddelde
expressie vertegenwoordigtvan een paaÍ
honderdduizendindividuelecellen,maaktdit
soortexperimentensuperieuraan de analyse
grote
van,
hoeveelheden, stabiele
transÍormanten.