Genetica van Kanker
advertisement
Genetica van Kanker en toepassing van moleculaire bepalingen in de routine pathologie diagnostiek Winand Dinjens Afdeling Pathologie Josephine Nefkens Instituut (JNI) Erasmus MC, Rotterdam Basiscursus Oncologie, 2 februari 2009, Ellecom Statement: Kanker is een ziekte van het DNA DNA in de Cel chromosome cell nucleus Double stranded DNA molecule Individuele nucleotiden Karyogram van normale cellen van een man Het genoom • 2 x 23 chromosomen • 2 x 3.000.000.000 baseparen • 2 x 20.000 genen DNA: 3 x 9 10 baseparen Haploide genoom = 3 x 109 basen 3 x 109 bp = 6 x 109 basen Diploide genoom: 12 x 109 basen 3 x 106 dubbelzijdige A4 (pts 12) = 150 meter GEN (DNA) mRNA Eiwit gemuteerd Gen (DNA) * * gemuteerd mRNA gemuteerd * Eiwit Normale cel meerdere genetische veranderingen ongecontroleerde groei clonale expansie benigne tumor meerdere genetische veranderingen invasief en metastaserend maligne tumor Mutator hypothese Tumorcellen accumuleren mutaties • chromosomale instabiliteit (CIN) • microsatelliet instabiliteit (MIN) Karyogram van normale cellen van een man Chromosomale instabilieit (CIN) Spectraal karyogram van een kankercel MICROSATELLIET INSTABILITEIT N T (MSI) MSS MSI Proto-oncogenen activatie Oncogenen (gereguleerd) (gedereguleerd) activatie celcyclus activatie celcyclus remming apoptose remming apoptose Kankergenen I: RAS ACTIVERING CELCYCLUS RAS-GTP RAS-GDP GROEIFACTOR CYCLIND/ CDK4↑ ↑ Kankergenen I: RAS AUTONOME CELCYCLUS RAS-GTP RAS-GDP --GTGGGCGCCGGCGGTGTGGGC--- Val Gly Ala Gly Gly Val Gly --GTGGGCGCCGTCGGTGTGGGC--- Val Gly Ala Val Gly Val Gly CYCLIND/ CDK4↑ ↑ Tumorsuppressorgenen inactivatie remming celcyclus remming geïnactiveerd stimuleren apoptose apoptose geremd DNA schade DNA Normale cel P53 P53 Hoge concentratie P53 eiwit Verandering van expressie van P53 gereguleerde genen Stop in G1- fase cel cyclus apoptosis DNA herstel P53 negative cel P53 Niet - functioneel P53 Geen verandering van expressie van P53 gereguleerde genen Geen stop in de cel cyclus Geen DNA herstel of cel-dood Grote kans op mutaties die aanleiding geven tot een tumor cel GENETISCHE STABILITEIT GENETISCHE INSTABILITEIT PROTO-ONCOGEN ACTIVATIE EN TUMORSUPPRESSORGEN INACTIVATIE Tumor fenotype afwijking wildtype PROTO-ONCOGEN ACTIVERENDE MUTATIE DELETIE OF INACTIVERENDE TUMOR SUPPRESSORGEN MUTATIE DELETIE OF INACTIVERENDE MUTATIE Tumoren: A: clonaal B: DNA afwijkingen (CIN en MIN) C: activatie proto-oncogenen D: inactivatie tumorsuppressorgenen PATHOLOGIE Tumor macroscopie PATHOLOGIE Tumor macroscopie Tumor histologie PATHOLOGIE Resectie randen macroscopie PATHOLOGIE Resection borders macroscopy Resectie randen histologie PATHOLOGIE Histologie H&E PATHOLOGIE Histologie H&E Immunohistochemie NCL5D3 PATHOLOGIE Histologie PATHOLOGIE Histologie Moleculaire bepaling P53 mutatie Toepassing van moleculaire bepalingen in de routine pathologie diagnostiek van solide tumoren Bepaling clonale relatie tussen meerdere tumoren binnen één patiënt Tumorcellen onderscheiden zich van normale cellen door het voorkomen van afwijkingen in hun DNA Die DNA afwijkingen kunnen worden gebruikt als tumor-specifieke clonale markers DNA polymorfismen: In de natuur voorkomende variatie in de DNA volgorde binnen één soort Polymorfismen Microsatelliet: CA/TG di-nucleotide repeat aatgcCACACACACACACACACACACAgggat ttacgGTGTGT GTGTGTGTGTGTGTGTcccta Aantal CA: 19, 20, 21, 22, 23, 24 Frequentie: 0,1 - 0,3 - 0,1 - 0,2 - 0,05 - 0,25 Polymorfismen CA/TG di-nucleotide repeat: - Hoog polymorf (19-20-21-22-23-24) - Frequent in het genoom ( > 30.000 maal) - Geflankeerd door uniek DNA Analyse van polymorfe microsatellieten om DNA afwijkingen te detecteren Loss Of Heterozygosity (LOH) NORMAAL DNA p p q q CA(20) 14(a) 14(b) Heterozygoot 14(a) (CA)20 14(b) (CA)15 CA(15) PCR amplificatie van normaal DNA Hoog-resolutie fragment scheiding Analyse van polymorfe microsatellieten om DNA afwijkingen te detecteren Loss Of Heterozygosity (LOH) NORMAAL DNA p p q q CA(20) 14(a) 14(b) 14(a) (CA)20 14(b) (CA)15 CA(15) PCR amplificatie van normaal en tumor DNA Hoog-resolutie fragment scheiding NORMAAL Heterozygoot TUMOR DNA p p q CA(20) 14(a) 14(b) Analyse van polymorfe microsatellieten om DNA afwijkingen te detecteren Loss Of Heterozygosity (LOH) NORMAAL DNA p p q q CA(20) 14(a) 14(b) 14(a) (CA)20 14(b) (CA)15 CA(15) p p PCR amplificatie van normaal en tumor DNA q CA(20) Hoog-resolutie fragment scheiding NORMAAL Heterozygoot TUMOR DNA TUMOR LOSS LOH 14(a) 14(b) Vrouw 49 jaar: Mammatumor (T1) 35 maanden later tumor (T2) in lies lymfeklier Vraag: tumor in liesklier metastase mammatumor? DNA isolatie: - normaal weefsel - mammatumor (T1) - liesklier tumor (T2) LOH-analyse: hoog % tumorcellen P53 mutatie-analyse Mammatumor (T1) Lymfeklier tumor (T2) Laser Capture Microscopie microdissectie D13S155 N T1 LOH - Upper T2 No - loss T1 # T2 D8S133 N T1 No - loss T2 LOH - Lower T1 # T2 D17S786 N T1 LOH T2 LOH T1 # T2 Lower Upper P53 sequencing (exon 8) N TCT 269Ser T1 TCT TTT 296Ser Phe P53 sequencing (exon 5) N TGC 135Cys T2 TGC TAC 135Cys Tyr Resultaat: - Beide tumoren vertonen een verschillend LOH patroon en verschillende p53 mutaties Conclusie: - Lymfeklier metastase waarschijnlijk niet afkomstig van mammatumor Patiënte opnieuw onderzocht: Ovariumtumor (T3) LOH en p53 analyse Ovariumtumor (T3) D13S155 N T1 LOH - Upper T2 No - Loss T3 No - Loss T2 = T3 # T1 D8S133 N T1 No - Loss T2 LOH - Lower T3 LOH - Lower T2 = T3 # T1 D17S786 N T1 LOH T2 LOH Lower Upper LOH T3 T2 = T3 # T1 Upper P53 sequencing (exon 5) N T3 TGC 135Cys TGC TAC 135Cys Tyr (identiek T2) Resultaat: - Ovarium- (T3) en liesklier tumor (T2) identiek LOH patroon en identieke p53 mutatie - Mammatumor (T1) verschillend LOH patroon en andere p53 mutatie Conclusie: Lymfekliermetastase zeer waarschijnlijk afkomstig van ovariumtumor In de diagnostische Pathologie kunnen moleculaire bepalingen in een (beperkt) aantal gevallen extra informatie opleveren. De resultaten moeten echter geïnterpreteerd worden in de context van de routine Pathologie en de klinische gegevens. Samenvatting: • Kanker onstaat door veranderingen in protooncogenen en tumorsuppressorgenen • Er moeten meerdere genen in 1 cel veranderd zijn voordat een tumor kan ontstaan • Een aantal genen is bij veel soorten kanker betrokken; er zijn ook genen die maar bij 1 type kanker een rol spelen • Bepaling van DNA afwijkingen heeft klinische toepassingen Statement: Kanker is een ziekte van het DNA Klopt: de primaire oorzaak van kanker is gelegen in mutaties (in oncogenen en tumorsuppressorgenen)