16S-23S rDNA NGS: kansen en uitdagingen

19.10- 19.40 uur Resultaten uit de REMIS+ werkgroep Next Gen Sequencing:
Kweek onafhankelijke detectie en identificatie van bacteriële
species m.b.v. 16S-23S rDNA NGS: kansen en uitdagingen
Mirjam Kooistra-Smid, Medisch Moleculair Microbioloog, Certe
19.40-20.00 uur 16S-23S rDNA NGS op klinische samples van orthopedische
patiënten
Glen Mithoe, arts-microbioloog, Certe
20.00-20.20 uur 16S-23S rDNA NGS: meer dan je dacht
Alewijn Ott, arts-microbioloog , Certe
Kweek onafhankelijke detectie en
identificatie van bacteriële species
m.b.v. 16S-23S rDNA NGS:
kansen en uitdagingen
Mirjam Kooistra-Smid
08-05-2017
MMB Diagnostic Stewardship
Focus klinische microbiologie:
- snelle identificatie van pathogenen in klinische samples
- kweek en op PCR gebaseerde technieken
- 16S rDNA Sanger sequencing
- vaststellen van het resistentieprofiel
optimale behandeling van de individuele patiënt
Snelle diagnostiek verhoogt:
- bruikbaarheid van laboratorium resultaten
- toegevoegde waarde van de medische microbiologie
in het zorgnetwerk
4
Beperkingen huidige diagnostiek (1/2)
- conventionele kweek:
• Maldi-TOF
- identificatie bacteriële species niet altijd mogelijk
• moeilijke groeiers-kweek en identificatie gecompliceerd
time en resource consuming
• significante reductie van de gevoeligheid van de kweek
door antibiotische behandeling
Beperkingen huidige diagnostiek (2/2)
- PCR gebaseerde technieken
a priori inzicht van het verdachte pathogeen in het
klinisch monster is noodzakelijk
- 16S rDNA Sanger seqencing
• identificatie van sommige species is niet altijd mogelijk
• polymicrobiële samples: identificatie van species is erg
gecompliceerd
• present in all bacteria
• conserved function
• variable regions
Sequencing 16S rRNA gene (appr. 1,5 kb)
- highly useful in regards to bacterial classification
- poor discriminatory power for some genera
Patel. Mol. Diag., 2001
Michael Janda et.al. J Clin Microbiol., 2007
• present in all bacteria
• conserved function
• variable regions
Sequencing 16S rRNA gene (appr. 1,5 kb)
- highly useful in regards to bacterial classification
- poor discriminatory power for some genera
Patel. Mol. Diag., 2001
Sequencing 23S rRNA gene (appr. 2,9 kb)
- highly useful in regards to bacterial classification
- high sequence variation
Hunt et. al. Appl. Environ. Microbiol. 72, 2006
Challenge: sequencing whole 16S -23S rRNA region
Kweek onafhankelijke diagnostische methode voor
detectie en identificatie van bacteriële species
• Next Generation Sequencing (NGS)
• Benchtop sequencers
Diagnostic tool
• Metagenomics
• Targeted NGS
2005 - 2017
kweek/PCR
16S-23S rDNA NGS
2018 - 2020
kweek/PCR
16S-23S rDNA NGS
2021 - xxxx
kweek/PCR
16S-23S rDNA NGS
metagenomics
DNA extraction
16S-23S rDNA PCR
NGS
16S-23S rDNA NGS
Short reads
Result 16S-23S rDNA NGS analysis
Contig assembly
Conventional diagnostics
Modern diagnostics
Complex clinical materials
Culture of fastidious micro-organisms
Day 0
Culture positive
Week 1
Culture positive
Culture negative
Week 2
Culture positive
MALDI-TOF
16S rDNA Sanger sequencing
Week 3
16S rDNA Sanger sequencing Week 4
16S-23S rDNA NGS
Microbiome identification
(multiple bacterial species)
Applications:
- Primary sterile clinical materials
- Samples orthopedic patients
- Samples endocarditis patients
- Urine samples
6
16S-23S rDNA NGS Project
Doel:
Ontwikkeling, validatie en implementatie van een robuuste
kweek onafhankelijke diagnostische methode gebaseerd op
targeted next generation sequencing van de 16S-23S rDNA regio
voor de detectie en identificatie van bacteriële species in
complexe klinische monsters.
Subdoelen
- Ontwikkelen identificatie methode met een hoog discriminerend vermogen
- DNA-extractie
Bacteriële isolaten
- 16S-23S rDNA PCR
- targeted NGS
- data-analyse
Klinische materialen
- data rapportage
- Ontwikkelen software pipeline
- Ontwikkelen database met 16S-23S rRNA sequenties
- Verrichten prospectieve klinische validatie studies
- Implementatie 16S-23S rDNA NGS in de reguliere diagnostiek
16S-23S rDNA NGS Bacterial isolates
Materials:
52 clinical strains
15 reference strains from the ATCC collection
Encompassing 24 genera and 58 species
Achromobacter marplatensis
Enhydrobacter aerosaccus
Staphylococcus epidemidis
Acinetobacter boumanii
Enterobacter aerogenes
Staphylococcus epidermidis
Acinetobacter ilwofii
Enterococcus faecalis
Staphylococcus haemolyticus
Acinetobacter johnsonii
Acinetobacter lwoffii
Acinetobacter parvus
Enterococcus faecium
Enterococcus feacalis
Escherichia coli
Staphylococcus hominis
Staphylococcus lentus
Staphylococcus lugdunensis
Actinobaculum schaalii
Actinomyces graevenitzii
Granulicatella adiacens
Klebsialla pneumoniae
Staphylococcus spp.
Streptococcus dysgalactiae
Actinomyces neuii subsp. anitratus Lactobacillus fermentum
Streptococcus feacalis
Actinomyces turicensis
Streptococcus gordonii
Bacillus cereus
Citrobacter freundii
Citrobacter youngae
Lactobacillus paracasei subsp.
paracasei
Lactobacillus rhamnosus
Moraxella catarrhalis
Moraxella catharalis
Corynebacterium afermentans
Moraxella lacunata
Streptococcus pasteurianus
Corynebacterium amycolatum
Moraxella osloensis
Streptococcus pneumoniae
Corynebacterium coyleae
Pantoea dispersa
Streptococcus pyogenes
Corynebacterium diphtheriae
Propionibacterium acnes
Streptococcus sanguinis
Corynebacterium jeikeium
Corynebacterium
tuberculostearicum
Corynebacterium xerosis
Delftia acidovorans
Pseudomonas aeruginosa
Salmonella enteritidis
Streptococcus species
Streptococcus vestibularis
Shigella soneii
Staphylococcus aureus
Yersinia enterocolitica
Dermabacter hominis
Staphylococcus capitis
Streptococcus mitis
Streptococcus mutans
Streptococcus parasanguinis
16S-23S rDNA NGS Bacterial isolates
Identification methods:
I.
Maldi-TOF: Microflex MS (Bruker)
II. Maldi-TOF: VITEK MS (bioMérieux)
III. Sanger sequencing of the whole 16S rRNA gene
LPW57 5′-AGTTTGATCCTGGCTCAG-3′ (Woo et. al., 2001)
LPW58 5′-AGGCCCGGGAACGTATTCAC-3′ (Woo et. al., 2001)
IV. NGS of the 16S-23S rRNA region
27F (5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’) (Sergeant et. al., 2012)
2490R (5’-GACATCGAGGTGCCAAAC-3’) (Hunt et. al., 2006)
MiSeq sequencer (Illumina)
Additional identification by sequence analysis of species specific genes
Discriminatory potential of identification methods
Method
Species level Genus level
16S-23S rDNA NGS
92.5%
100%
16S rDNA Sanger sequencing
56.7%
94.0%
Microflex MS
73.1%
88.1%
Vitek MS
64.2%
83.6%
The discriminatory power of species level identification using 16S-23S NGS is
significantly higher than 16S rDNA Sanger Sequencing, Vitek MS and Microflex
MS (p<0.0001, p=0.0060 and p<0.0001, respectively). (McNemar's test)
The discriminatory power of genus level identification using 16S-23S NGS is
significantly higher than Vitek MS and Microflex MS (p=0.0026 and p=0.0233,
respectively). (McNemar's test)
Sabat et.al.; accepted for publication
16S-23S rDNA NGS: clinical materials
Proof of principle
Materials:
urine samples from patients suspected for urine tract infection (n=60)
positive blood culture samples (n=23)
Biopsies and punctates from orthopedic patients (n=21)
Methods:
- Conventional culture
- urine samples: blood agar, MacConkey agar; Vitek MS)
- positive blood culture samples: Blood agar + 5% sheepblood,
Chocolate medium, en Brucella blood agar + 5% sheepblood; Vitek MS
- biopsies/punctates: Blood agar base , Chocolate medium,
Brucella blood agar + 5% sheepblood, Tryptone soya broth; Vitek MS
Methods:
- 16S-23S rDNA NGS method
 DNA-extraction
*urine samples: UltraClean Microbial DNA Isolation Kit (Mobio)
*positive blood culture samples: BiOstic Bacteraemia DNA Isolation Kit (Mobio)
*biopsies/punctates: Purelink Genomic DNA purification kit (Invitrogen)
 PCR amplification of 16S-23S rRNA region
- 27F (5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’)
- 2490R (5’-GACATCGAGGTGCCAAAC-3’)
 Library preparation
Nextera XT DNA Sample Preparation Kit (Illumina)
 Next Generation Sequencing
- MiSeq reagent cartridge; MiSeq reagent kit v3 and 600 cycles (Illumina)
- MiSeq (Illumina)
Methods:
- 16S-23S rDNA NGS method
 de novo reads assembly: SeqMan NGen software (DNASTAR)
 Assigning contigs to bacterial species
• Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) search of contig
16S-23S rRNA sequences in the GenBank database
• Similarity score
o > 99%:
species identification
(and difference with next closest species > 0.2%)
o 90%-99%:
o < 90%:
genus identification
unidentified organism
Sabat et.al.; accepted for publication
Sabat et.al.; accepted for publication
Sabat et.al.; accepted for publication
WORKFLOW 16S-23S rDNA NGS(n= 21 samples, 3 controls)
Clinical material/ cultured bacteria
Day
1
DNA extraction
&
16-23S rDNA PCR amplification
(Purelink genomic DNA minikit,
Phire hot start II DNA polymerase)
Day
2
PCR fragment detection and
purification
NGS library preparation
(Nextera XT DNA library Preparation kit
Friday to
Monday
Day
3-5
Day
6-7
Illumina sequencing
(MiSeq Reagent kit v3 600 cycle)
Data analysis
CLCbio (Qiagen), NCBI BLAST
Clinical sample:
1-2 million reads/sample
Minimum length contig: 1500 bp
Experimentele uitslag
16-23S rDNA NGS analysis
Corynebacterium propinquum
Propionibacterium acnes
Microvirga sp.
Brevundimonas vesicularis
Micrococcus luteus
Brevundimonas sp.
Paracoccus sp.
16S-23S rDNA NGS analyse
Contig
Identities
IDScore
Fraction %
NGS ID score interpretation
Species identification
Genus identification
Unidentified m.o.
Contig
(bp)
4538
4131
4160
1364
4400
1350
2333
Identities
4505/4523
2552/2552
3909/4193
1358/1365
4392/4424
726/751
2027/2095
ID
score Fraction %
0.996
18%
1.000
13%
0.932
2%
0.995
4%
0.993
2%
0.967
2%
0.968
1%
Name species assigned to contig
Length of contig (bp)
Matching of contig (query) with subject
Query/subject
Percentage identified reads
ID Score >0,986
ID Score >0,90 - <0,986
ID Score <0,90
Conclusies
16S-23S rDNA NGS:
• superieure identificatie bacteriele species
• kweekonafhankelijke detectie van polymicrobiële samples
• correcte identificatie klinisch relevante pathogenen
• hoge potentie voor detectie van pathogenen die niet
gekweekt kunnen worden
• gevoeligheid t.o.v. 16S Sanger sequencing fors verhoogd
• uitslag mogelijk < 6-7dagen
Uitdagingen:
• complexe analyse
ontwikkeling software-pipeline
• ontwikkeling database 16S-23S rDNA sequenties
• test versnellen
• klinische prospectieve validatie
onderscheid contaminant/kolonisant/oorzaak van infectie
16S-23S rRNA NGS Project
Retrospectieve klinische validatie
Proof of principle geleverd
Validatie diagnostische
methode
Start project
Evaluatie 6 maanden
Q1
2017
2016
2015
Q4
Q1
Q4
Q1
2018
Q4
Q1
Q4
Evaluatie 12 maanden
Implementatie diagnostische
methode in reguliere diagnostiek
Methode ontwikkeling
Instellen aandachtsgebied NGS
Prospectieve klinische validatie
Ontwikkeling diagnostische methode
Projectgroep 16S-23S rDNA NGS
Artur Sabat
Evert van Zanten
Guido Wisselink
Viktoria Akkerboom
Natacha Couto
Brigitte Dijkhuizen
Linda Veloo
Richard de Boer
Willem Vogels
Alewijn Ott
Glen Mithoe
Alexander Friedrich
John Rossen
Mirjam Kooistra-Smid
Met dank aan
Julia Berends
Emmy de Paus
Circe van der Heide
UMCG
Certe
Certe
UMCG
UMCG
UMCG
UMCG
Certe
Certe
Certe
Certe
UMCG
UMCG
Certe/UMCG