EPR-studie van X-stralen ge¨ınduceerde stabiele radicalen

Universiteit Gent
Faculteit Wetenschappen
Vakgroep Vastestofwetenschappen
Academiejaar 2010-2011
EPR-studie van X-stralen
geı̈nduceerde stabiele radicalen in
threonine eenkristallen.
Gertjan Scheir
Promotor: Prof. Dr. F. Callens
Copromotor: Prof. Dr. H. Vrielinck
Commissaris: Prof. Dr. D. Poelman
Begeleidster: M. A. Tarpan
Masterproef ingediend tot het behalen van de graad van
Master in de fysica en sterrenkunde
Dankwoord
Graag wil ik een paar mensen bedanken die onmisbaar waren om deze thesis
tot stand te laten komen.
Eerst wil ik mijn promoter Prof. Dr. Freddy Callens bedanken om mij toe
te laten mijn masterproef bij hem te volgen en om de begeleiding, kritische
opmerkingen en steun tijdens het maken van deze masterproef.
Daarnaast wil ik mijn copromotor Prof. Dr. Henk Vrielinck bedanken voor
de raad en zorg tijdens de soms lange meetdagen.
Ook wil ik Prof. Dr. Dirk Poelman bedanken als lid van de leescommissie.
Een speciaal woordje van dank gaat naar mijn begeleidster Mihaela Adeluta
Tarpan. Thank you for all the guidance and support. Your critical view on
things has helped me enormous in the making of my thesis. Also thanks for
the answers to my, sometimes stupid, questions.
Daarnaast wil ik ook Hendrik, Johan Van Driessche en Johan Lauwaert
bedanken voor de raad en fijne sfeer in de vakgroep.
Dank ik nog mijn familie, vrienden en alle mensen die, rechtstreeks of onrechtstreeks, geholpen hebben tijdens deze drukke periode. Graag wil ik, als
dirigent, de leden van het Sint-Gregoriuskoor te Oostende en het koor Cantate Domino Deinze bedanken voor de onontbeerlijke afleiding, ontspanning
en begrip in de periode tijdens het maken van deze masterproef.
Gertjan Scheir
i
Structuur van deze
masterproef
In Hoofdstuk 1 wordt de theoretische achtergrond gegeven nodig voor de
elektronen magnetische resonantiemetingen die in deze masterproef gebruikt
worden. In het eerste deel worden begrippen als spin, magnetisch moment
en de spinhamiltoniaan geı̈ntroduceerd. Vervolgens worden de resonantietechnieken EPR en ENDOR besproken.
In hoofdstuk 2 wordt ingegaan op de hyperfijninteractie. Eerst wordt een
theoretische interpretatie uiteengezet, daarna volgt een meer praktische benadering om het hoofdstuk te eindigen met een voorbeeld van een hyperfijninteractie in fructose.
Hoofdstuk 3 bespreekt een aantal aminozuren en handelt over de interactie
van straling met materie. Verschillende toepassingen van resonantiemetingen komen aan bod, alsook het belang van het aminozuur threonine, dat in
deze masterproef wordt bestudeerd. Het hoofdstuk sluit af met een overzicht
van de literatuur over 2 belangrijke aminozuren: glycine en alanine.
Hoofdstuk 4 handelt over de experimentele opstelling. Eerst worden de verschillende componenten van de spectrometer besproken. Vervolgens wordt
er informatie over de kristalpreparatie (groei, oriëntatie, bestraling,...) gegeven.
Tenslotte worden in hoofdstuk 5 onze eigen experimentele resultaten uiteengezet. Na de bespreking en de conclusie volgen suggesties voor verder
onderzoek.
ii
Inhoudsopgave
Dankwoord
i
Structuur van deze masterproef
ii
1 Inleiding tot Elektronen Paramagnetische Resonantie
1
1.1 Magnetische interacties tussen een elektron, magnetische kernen en een magneetveld . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1
1.1.1 Magnetisch moment en spin van elektronen en kernen
1
1.1.2 De spinhamiltoniaan . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2
1.1.3 Het Zeemaneffect . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
1.1.4 De hyperfijninteractie . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6
1.1.5 De nucleaire Zeemaninteractie . . . . . . . . . . . . . . 6
1.2 Resonantietechnieken: EPR en ENDOR . . . . . . . . . . . . 7
1.2.1 EPR: principe voor een vrij elektron . . . . . . . . . . 7
1.2.2 Energieniveaus voor een systeem met S = 12 en I = 12
7
1
1
1.2.3 Energieniveaus voor een systeem met S = 2 , I1 = 2
en I2 = 12 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
1.2.4 Energieniveaus voor een systeem met S = 12 en I = 1 . 10
1.2.5 ENDOR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
2 De hyperfijnkoppeling
2.1 Theoretische interpretatie van de hyperfijnkoppeling
2.1.1 De anisotrope hyperfijnkoppeling . . . . . . .
2.1.2 De isotrope hyperfijnkoppeling . . . . . . . .
2.1.3 Hyperfijnkoppeling van α-protonen . . . . . .
2.1.4 Hyperfijnkoppeling van β-protonen . . . . . .
2.1.5 Hyperfijnkoppeling van γ-, δ-,...protonen . . .
2.2 Bespreking van de hyperfijninteractietensor . . . . .
2.2.1 Bepaling van de hyperfijninteractietensor . .
2.2.2 Site splitting . . . . . . . . . . . . . . . . . .
iii
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
16
16
16
18
19
22
23
23
23
30
2.3
Voorbeeld: interactie van een ongepaard elektron met een
proton in fructose . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32
3 Inleiding tot aminozuren
3.1 Belang van aminozuren in het lichaam . . . . . . . . . . . .
3.1.1 Aminozuren, polypeptiden en proteı̈nen . . . . . . .
3.1.2 Vorming van proteı̈nen uit aminozuren . . . . . . . .
3.2 Straling en materie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.2.1 Straling . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.2.2 Interactie van ioniserende straling met materie . . .
3.2.3 Vorming van radicalen . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.2.4 Toepassingen van EMR op bestraalde biomoleculen .
3.3 Belang van threonine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.3.1 Threonine als dosimeter . . . . . . . . . . . . . . . .
3.3.2 Biologisch belang van threonine . . . . . . . . . . . .
3.4 Literatuurstudie: alanine en glycine . . . . . . . . . . . . .
3.4.1 Glycine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.4.2 Alanine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4 Meetopstelling
4.1 Spectrometer . . . . . . . . . . . .
4.1.1 Microgolfbrug . . . . . . . .
4.1.2 Caviteit . . . . . . . . . . .
4.1.3 Magneet . . . . . . . . . . .
4.1.4 Modulatiesysteem . . . . .
4.1.5 Uitbreidingen voor ENDOR
4.2 Kristalpreparatie . . . . . . . . . .
4.2.1 Threonine . . . . . . . . . .
4.2.2 Bestraling van het kristal .
4.2.3 Oriëntatie van het kristal .
. . . . . .
. . . . . .
. . . . . .
. . . . . .
. . . . . .
metingen
. . . . . .
. . . . . .
. . . . . .
. . . . . .
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
37
37
37
38
42
42
42
44
45
46
46
47
48
48
50
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
58
58
60
61
65
65
67
67
67
69
70
5 Experimentele resultaten
5.1 EPR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.2 ENDOR en EIE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.2.1 Het EIE spectrum voor de a-as volgens het magneetveld
5.2.2 Het EIE spectrum voor de b-as volgens het magneetveld
5.2.3 Het EIE spectrum voor de c-as volgens het magneetveld
5.2.4 Opmerkingen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.3 Hyperfijninteractietensoren voor radicaal R1 . . . . . . . . . .
iv
72
72
74
78
78
79
79
84
5.4
5.5
5.6
Temperatuursafhankelijkheid van de EPR spectra . . . . . . . 87
Bespreking van de resultaten en conclusies . . . . . . . . . . . 88
Suggesties voor verder onderzoek . . . . . . . . . . . . . . . . 91
Bibliografie
93
v
Hoofdstuk 1
Inleiding tot Elektronen
Paramagnetische Resonantie
1.1
Magnetische interacties tussen een elektron,
magnetische kernen en een magneetveld
1.1.1
Magnetisch moment en spin van elektronen en kernen
Een geladen deeltje, dat een gesloten baanbeweging beschrijft, zal een mag~ Dit
netisch moment opwekken ten gevolge van het baanimpulsmoment L.
~ gemeten in eenheden h̄, bedraagt:
magnetisch moment, met L
q h̄ ~
L,
2m
µ
~L =
met m de massa en q de lading van het deeltje en h̄ =
constante van Planck.
(1.1)
h
2π
de gereduceerde
Voor een elektron is q = −e en m = me . Het magnetisch moment van een
elektron ten gevolge van het baanimpulsmoment is:
µ
~L = −
eh̄ ~
~
L = −µB L
2me
(1.2)
met µB het Bohrmagneton gegeven door [1]:
µB =
1
eh̄
.
2me
(1.3)
1.1. Magnetische interacties tussen een elektron, magnetische kernen en
een magneetveld
Er bestaat, naast het baanimpulsmoment, ook een tweede impulsmoment,
~ genaamd spin. De spin van het elektron volgt uit het experiment van
S,
Stern-Gerlach [2] en werd gepostuleerd door Goudsmit en Uhlenbeck.
De spin wekt ook een magnetisch moment, µ
~ S , op. Algemeen kan het
verband tussen de spin en het magnetisch moment ten gevolge van de spin
van een deeltje geschreven worden als:
µ
~S = γ
q h̄ ~
S
2m
(1.4)
met γ de gyromagnetische verhouding van het deeltje. De spin wordt eveneens gemeten in eenheden h̄.
Voor een elektron (γ = ge ≈ 2.0023) bekomen we:
~
µ
~ S = −ge µB S.
(1.5)
Meer algemeen kunnen we schrijven dat:
~
µ
~ S = −gµB S
(1.6)
~ een effectieve spin (zie sectie 1.1.2). Het
met een algemene g-factor en S
totaal magnetisch moment van een elektron bedraagt (vgln. 1.2 en 1.5):
~ + ge S)
~
µ
~ = −µB (L
(1.7)
Analoog hebben sommige kernen een spin I~ en spinmoment µ
~ N met als
~
~
relatie (vgl. 1.4 met S = I, γ = gN en m = mp ) [3]:
µ
~ N = gN µN I~
(1.8)
waarbij gN de gyromagnetische verhouding van de kern is en µN het nucleair
magneton, gegeven door:
eh̄
,
(1.9)
µN =
2mp
met mp de massa van het proton.
1.1.2
De spinhamiltoniaan
In de kwantummechanica wordt een systeem beschreven door een golffunctie
en grootheden worden operatoren. Beschouwt men de tijdsonafhankelijke
2
1.1. Magnetische interacties tussen een elektron, magnetische kernen en
een magneetveld
Schrödingervergelijking Ĥψ = Eψ, dan wordt de energie E van het systeem
gevonden als de eigenwaarde van de hamiltoniaan van het systeem. In
sectie 2.2 wordt het bepalen van de eigenfucties en de eigenwaarden uit
de hamiltoniaan praktisch uitgewerkt. De hamiltoniaan van een systeem
is doorgaans zeer complex en de tijdsonafhankelijke Schrödingervergelijking
heeft meestal geen exacte oplossing. Om de energieniveaus te berekenen,
dient men beroep te doen op een benaderende techniek: perturbatierekenen,
waarbij kleine interacties worden gezien als storingen op grotere interacties.
De Boltzmanndistributie drukt, bij thermisch evenwicht, de bevolking van
de energieniveaus van een systeem uit in functie van de temperatuur [4]:
Ei
Ni = Ae− kT .
(1.10)
Hier is Ni de bevolking van het energieniveau Ei , k de Boltzmannconstante,
A een normeringsconstante en T de temperatuur. Bij lage thermische energieën (lage T) worden enkel de laagste energieniveaus bezet. De probabiliteit dat hogere energieniveaus bevolkt worden, neemt exponentieel af
(vgl. 1.10). Hierdoor kunnen we de energieniveaus dicht bij de energie van
de grondtoestand als geı̈soleerd beschouwen.
In dit geı̈soleerde systeem kunnen we de complexe totale hamiltoniaan vervangen door een handelbare effectieve spinhamiltoniaan. Deze wordt opgebouwd uit spinoperatoren en spinparameters. De waarde van de spin en
de spinoperatoren worden gebruikt om het juiste aantal energieniveaus te
reconstrueren. Spinparameters bundelen de effecten die niet van spinoperatoren afkomstig zijn en zorgen voor de juiste waarde van de energieniveaus,
zoals ze worden bepaald door de totale complexe hamiltoniaan. In wat volgt
~ˆ
~ˆ en I.
noteren we, voor de eenvoud, de effectieve spinoperatoren als S
De spinhamiltoniaan voor de interactie tussen een elektron en een kern in
~ heeft volgende vorm:
een magneetveld B
~ · ḡ¯ · S
~ˆ + S
~ˆ · Ā¯ · I~ˆ − gN µN B
~ · I.
~ˆ
Ĥspin = µB B
(1.11)
De verschillende termen worden in de volgende secties (1.1.3, 1.1.4, 1.1.5)
besproken.
ˆ
Voor n kernen, elk met spinoperator I~ 6= 0, wordt vgl. 1.11:
n
X ˆ ¯ ˆ
~ · ḡ¯ · S
~ˆ +
~ · Āi · I~i − gN,i µN B
~ · I~ˆi ].
Ĥspin = µB B
[S
i=1
3
(1.12)
1.1. Magnetische interacties tussen een elektron, magnetische kernen en
een magneetveld
1.1.3
Het Zeemaneffect
Als men een elektron in een magneetveld plaatst, kan men de potentiële
energie, met µ het magnetisch moment van het elektron, schrijven als [5]:
d~
~ = −µB cos (µ
E = −~
µ·B
~ , B).
(1.13)
Bij de overstap naar de kwantummechanica wordt het magnetisch moment
~ = 0), dan wordt vgl. 1.7:
een operator. Beschouwen we een vrij elektron (L
~ˆ
µ
~ˆ = −ge µB S.
(1.14)
We bekomen, uit vgl. 1.13, voor de hamiltoniaan:
~
ĤEZ = −µ
~ˆ · B,
(1.15)
met HEZ de elektronische Zeemanhamiltoniaan.
~ˆ gekwantiseerd
~ = B e~z ) en S
We kiezen de z-as volgens het magneetveld (B
volgens de z-as Ŝz . Rekening houdend met 1.14, kunnen we de elektronische
Zeemanhamiltoniaan schrijven als
ĤEZ = ge µB B Ŝz .
(1.16)
~ˆ = 1 en zijn er slechts twee magnetische spinVoor een elektron is S = |S|
2
toestanden Ms = ±1/2. De spinoperator, inwerkend op de golffunctie van
het systeem, heeft als eigenwaarde de magnetische spintoestand (Ms ):
1
1
1
Ŝz ψ(Ms = + ) = + ψ(Ms = + )
2
2
2
1
1
1
Ŝz ψ(Ms = − ) = − ψ(Ms = − ).
2
2
2
(1.17)
(1.18)
Uit vgl. 1.16 kunnen we de bijhorende energieniveaus vinden (zie figuur
1.1):
1
E+ =ge µB B
2
1
E− = − ge µB B
2
(1.19)
(1.20)
Dit komt overeen met een parallelle oriëntatie van het magneetveld en de
spin van het electron (en bijgevolg antiparallel met het magnetisch moment
van het elektron) en een antiparallelle oriëntatie van het magneetveld en de
4
1.1. Magnetische interacties tussen een elektron, magnetische kernen en
een magneetveld
Figuur 1.1: Het Zeemaneffect.
spin (parallel met het magnetisch moment) respectievelijk. De opsplitsing
ten gevolge van een magneetveld (vgln. 1.19 en 1.20) heet het Zeemaneffect.
Bij afwezigheid van een magneetveld vallen beide energieniveaus samen.
Algemeen is de elektronische Zeemaninteractie niet isotroop. Ze wordt
beschreven door volgende formule, zoals aangegeven in de eerste term van
vgl. 1.11:
~ˆ
~ · ḡ¯ · S
ĤEZ = µB B
(1.21)
met


g
gxy gxz
 xx


¯
ḡ = gyx gyy gyz 

gzx gzy gzz
(1.22)
de g-tensor. In de g-tensor zitten de effecten die niet van spinoperatoren
afkomstig zijn, vervat. De g-waarden met verschillende indices kan men als
volgt interpreteren: gxy beschrijft de contributie aan de g-factor (g in vgl.
1.6) langs de y-as wanneer het magneetveld volgens de x-as is gericht.
In het hoofdassenstelsel van de g-tensor is deze diagonaal met op de diago-
5
1.1. Magnetische interacties tussen een elektron, magnetische kernen en
een magneetveld
naal de hoofdwaarden:


g
0 0

 x

ḡ¯ = 
 0 gy 0  .
0 0 gz
1.1.4
(1.23)
De hyperfijninteractie
~ =
Kernen met I = |I|
6 0 hebben een magnetisch moment (vgl. 1.8) dat
verschillende waarden kan aannemen: I = 12 , 1, 23 , 2, 52 , 3, ... en met multipliciteit (2I + 1) [3]. De interactie tussen het magnetisch moment van een
elektron en het magnetisch moment van een naburige kern van dezelfde
molecule wordt de hyperfijninteractie genoemd. Indien de kern niet tot
dezelfde molecule als het elektron behoort, spreekt men van superhyperfijninteractie.
De hyperfijninteractieterm correspondeert met de tweede term in vgl. 1.11:
ˆ
ĤHF = Ŝ · Ā¯ · I.
(1.24)
Hierbij is Ā¯ de hyperfijninteractietensor.
Deze tensor zal doorgaans niet isotroop zijn, maar kan opgesplitst worden
in een isotroop en anisotroop deel [6]:


A
Axy,aniso Axz,aniso
 xx,aniso


Ā¯ = A0 · I + 
Ayx,aniso Ayy,aniso Ayz,aniso 
Azx,aniso Azy,aniso Azz,aniso
(1.25)
met A0 de isotrope hyperfijnkoppeling en I de eenheidstensor. De oorsprong
van isotrope en anisotrope hyperfijnkoppeling zullen in secties 2.1.1 en 2.1.2
besproken worden. Het anisotroop deel van de hyperfijntensor zal steeds
spoorloos zijn.
Het eenvoudigste geval van een hyperfijninteractie, of hyperfijnopsplitsing,
is deze tussen het elektron en de waterstofkern in het waterstofatoom.
1.1.5
De nucleaire Zeemaninteractie
De interactie tussen de kernspins en het magneetveld wordt de nucleaire
Zeemaninteractie genoemd. In vgl. 1.11 wordt de nucleaire Zeemanterm
voorgesteld door:
~ · I,
~ˆ
ĤN Z = −gN µN B
(1.26)
6
1.2. Resonantietechnieken: EPR en ENDOR
waarbij de nucleaire Zeemantensor bij benadering isotroop is beschouwd:
ḡ¯N Z = gN I.
Aangezien µN ∼ m1p << m1e ∼ µB ≈ 1863µN , zal de nucleaire Zeemaninteractie veel kleiner zijn dan de elektronische Zeemaninteractie.
1.2
1.2.1
Resonantietechnieken: EPR en ENDOR
EPR: principe voor een vrij elektron
Bij Elektronen Paramagnetische Resonantie (EPR) worden elektronovergangen geı̈nduceerd tussen verschillende Zeemanenergieniveaus. Hiervoor
plaatst men het specimen in een magneetveld en laat men elektromagnetische stralen (microgolven) invallen.
Indien we enkel de elektronische Zeemaninteractie beschouwen, geven vgln.
1.19 en 1.20 de energieniveaus van een elektron in een magneetveld. De
straling zal geabsorbeerd worden als aan de resonantieconditie voldaan is:
∆E = ge µB B = hν,
(1.27)
met ν de frequentie van de invallende straling.
We zouden het specimen in een vast magneetveld kunnen plaatsen en de
golflengte van de straling kunnen laten variëren. Bij welbepaalde frequenties
van de straling (resonantieconditie, vgl. 1.27) zal de straling geabsorbeerd
worden, wat zou resulteren in een lijn in het EPR spectrum. In de praktijk
is het handiger om de waarde van de frequentie vast te laten en de grootte
van het magneetveld te laten variëren (zie figuur 1.2).
1.2.2
Energieniveaus voor een systeem met S =
1
2
en I =
1
2
Beschouwen we een systeem met één ongepaard elektron (S = 12 , MS = ± 21 )
en één interagerend proton (I = 21 , MI = ± 21 ). Veronderstel, voor de
eenvoud, dat de hyperfijninteractie en de elektronische Zeemaninteractie
isotroop zijn. De z-as is gekozen volgens de richting van het magneetveld.
De spinhamiltoniaan (vgl. 1.11) wordt:
Ĥspin = gµB B Ŝz + A0 (Ŝx Iˆx + Ŝy Iˆy + Ŝz Iˆz ) − gN µN B Iˆz ,
met g en A0 isotrope koppelingsparameters.
7
(1.28)
1.2. Resonantietechnieken: EPR en ENDOR
Figuur 1.2: Resonantievoorwaarde voor EPR met bijhorende spectrum.
Bres is de waarde van het magneetveld waar aan de resonantieconditie
voldaan is [7].
Met behulp van de braket notatie |MS MI i en de operatorregels 1.17-1.18,
kunnen we de verschillende energieniveaus tot op eerste orde uitrekenen.
EMS MI = hMS MI |Ĥspin |MS MI i
(1.29)
= hMS MI |gµB B Ŝz + A0 Ŝz Iˆz − gN µN B Iˆz |MS MI i
(1.30)
= MS gµB B + MS MI A0 − MI gN µN B,
(1.31)
of expliciet:
1
1
1
E 1 1 = gµB B + A0 − gN µN B
2 2
2
4
2
1
1
1
E 1 − 1 = gµB B − A0 + gN µN B
2
2
2
4
2
1
1
1
E− 1 1 = − gµB B − A0 − gN µN B
2 2
2
4
2
1
1
1
E− 1 − 1 = − gµB B + A0 + gN µN B
2
2
2
4
2
(1.32)
(1.33)
(1.34)
(1.35)
De selectieregels voor EPR zijn ∆MI = 0 en |∆MS | = 1. We kunnen,
8
1.2. Resonantietechnieken: EPR en ENDOR
rekening houdend met deze selectieregels, de overgangsenergieën berekenen:
1
∆E1 = E 1 1 ↔ E− 1 1 = gµB B + A0
2 2
2 2
2
1
∆E2 = E 1 − 1 ↔ E− 1 − 1 = gµB B − A0
2
2
2
2
2
(1.36)
(1.37)
Merk op dat de nucleaire Zeemaninteractie in eerste orde geen effect heeft
op EPR overgangen.
De resonantieconditie luidt:
1
hν = ∆E1 =gµB Bres1 + A0
2
1
hν = ∆E2 =gµB Bres2 − A0
2
(1.38)
(1.39)
met ν de frequentie van de invallende microgolven. Bres1 en Bres2 zijn twee
waarden van het magnetisch veld waar resonantie optreedt. We krijgen een
hyperfijndoublet in het absorptiespectrum.
1.2.3
Energieniveaus voor een systeem met S = 12 , I1 =
I2 = 12
1
2
en
Vervolgens kunnen we een systeem met één ongepaard elektron dat interageert met twee protonen beschouwen. Bij S = 21 , I1 = 12 en I2 = 21 krijgen
we normaal 8 energieniveaus. We beschouwen het geval waar de protonen
equivalent zijn (A0,I1 = A0,I2 = A0 ). De elektronische Zeemaninteractie en
de hyperfijninteractie beschouwen we isotroop. De z-as is gekozen volgens de
richting van het magneetveld. De spinhamiltoniaan voor meerdere kernen
(vgl. 1.12) wordt tot op eerste orde:
Ĥspin = gµB B Ŝz + A0 Ŝz [Iˆz,1 + Iˆz,2 ] − gN µN B[Iˆz,1 + Iˆz,2 ].
9
(1.40)
1.2. Resonantietechnieken: EPR en ENDOR
We kunnen de energieniveaus berekenen:
1
1
E 1 1 1 = gµB B + A0 − gN Z µN B
2 2 2
2
2
1
E 1 1 − 1 = gµB B
2 2
2
2
1
E 1 − 1 1 = gµB B
2
2 2
2
1
1
E 1 − 1 − 1 = gµB B − A0 + gN Z µN B
2
2
2
2
2
1
1
E− 1 1 1 = − gµB B − A0 − gN Z µN B
2 2 2
2
2
1
E− 1 1 − 1 = − gµB B
2 2
2
2
1
E− 1 − 1 1 = − gµB B
2
2 2
2
1
1
E− 1 − 1 − 1 = − gµB B + A0 + gN Z µN B
2
2
2
2
2
(1.41)
(1.42)
(1.43)
(1.44)
(1.45)
(1.46)
(1.47)
(1.48)
Merk op dat de toestanden | 12 21 − 12 i en | 21 − 12 21 i dezelfde energie hebben.
Alsook hebben de toestanden |− 12 12 21 i en |− 12 − 12 12 i dezelfde energie. We
houden nog 6 verschillende energieniveaus over.
Rekening houdend met de selectieregels voor EPR, bekomen we 3 hyperfijnovergangen:
∆E1 = E 1 1 1 ↔ E− 1 1 1 = gµB B + A0
(1.49)
∆E2 = E 1 − 1 1 ↔ E− 1 − 1 1 = gµB B
(1.50)
2 2 2
2
2 2 2
2 2
2
2 2
= E 1 1 − 1 ↔ E− 1 1 − 1
2 2
2
2 2
(1.51)
2
∆E3 = E 1 − 1 − 1 ↔ E− 1 − 1 − 1 = gµB B − A0
2
2
2
2
2
(1.52)
2
De overgangsenergie tussen de toestanden | 21 − 12 12 i en |− 12 − 21 12 i is gelijk
aan de overgangsenergie tussen de toestanden | 12 12 − 12 i en |− 12 12 − 12 i. Hierdoor zal de middelste piek in het EPR absorptiespectrum dubbel zo intens
zijn (zie figuur 1.3).
1.2.4
Energieniveaus voor een systeem met S =
1
2
en I = 1
We kunnen de vergelijking maken tussen het systeem beschreven in de vorige
sectie en een systeem met één ongepaard elektron en één kern met kernspin
I = 1. Een voorbeeld van zo een kern is 14 N .
10
1.2. Resonantietechnieken: EPR en ENDOR
Een kern met kernspin I = 1 kan drie verschillende magnetische spintoestanden aannemen: MI = 1, 0, −1. De berekening van de energieniveaus is
analoog als in sectie 1.2.2, waarbij Iz nu drie eigenwaarden heeft:
1
1
E 1 1 = gµB B + A0 − gN Z µN B
2
2
2
1
E 1 0 = gµB B
2
2
1
1
E 1 −1 = gµB B − A0 + gN Z µN B
2
2
2
1
1
E− 1 1 = − gµB B − A0 + gN Z µN B
2
2
2
1
E− 1 0 = − gµB B
2
2
1
1
E− 1 −1 = − gµB B + A0 − gN Z µN B
2
2
2
(1.53)
(1.54)
(1.55)
(1.56)
(1.57)
(1.58)
Rekening houdend met de selectieregels voor EPR bekomen we drie overgangen:
∆E1 = E 1 1 ↔ E− 1 1 = gµB B + A0
(1.59)
∆E2 = E 1 0 ↔ E− 1 0 = gµB B
(1.60)
∆E3 = E 1 −1 ↔ E− 1 −1 = gµB B − A0
(1.61)
2
2
2
2
2
2
In tegenstelling tot het voorbeeld uit de vorige sectie zal de intensiteit van
de drie hyperfijnabsorptiepieken even groot zijn (zie figuur 1.3).
1.2.5
ENDOR
In het EPR spectrum kunnen sommige lijnen dicht bij elkaar liggen waardoor sommige details, zeker in het geval van kleine hyperfijnopsplitsingen,
verloren kunnen gaan. Om meer informatie over de hyperfijnkoppelingen
te bekomen kan men beroep doen op Electron-Nuclear Double Resonance
(ENDOR). De ENDOR techniek werd in 1956 voorgesteld door Feher [8].
Er is een geval waarbij de hyperfijninteractie van een elektron met de 23ste
dichtste nabuur is onderzocht met behulp van ENDOR.
1.2.5.1
Werking van ENDOR: relaxatieprocessen
Voor ENDOR zijn er, in het geval van 4 energieniveaus (één hyperfijninteractie met I = 21 ), 3 verschillende relaxatiemechanismen van belang. Er
11
1.2. Resonantietechnieken: EPR en ENDOR
Figuur 1.3: Vergelijking tussen een systeem met twee equivalente protonen
(links) en een systeem met een stikstofatoom (rechts).
is de spin-rooster relaxatie van het elektron (met relaxatietijd τe ), de spinrooster relaxatie van de kern (met relaxatietijd τN ) en de cross relaxatie
(met relaxatietijd τx ). In figuur 1.4 staan de verschillende relaxatiepaden
aangegeven met de corresponderende relaxatietijden.
De overgang horende bij τe is een EPR overgang met selectieregels |∆MS | =
1 en ∆MI = 0. De overgang horende bij τN is een Nucleaire Magnetische
Resonantie (NMR) overgang met selectieregels ∆MS = 0 en |∆MI | = 1. De
overgang horende bij τx heeft selectieregel ∆Ms + ∆MI = 0. Hier treedt er
wederzijdse spinflip op en is er een cross relaxatie.
De relaxatietijden bepalen voor een groot deel het temperatuursgebied waar
we ENDOR kunnen gebruiken en is een groot nadeel van de hier beschreven
ENDOR techniek.
We willen een steady-state ENDOR experiment opzetten om de interactie
met bv. protonen te onderzoeken. We satureren eerst een EPR overgang,
bv. de overgang tussen niveau A en D in figuur 1.4. Dit bekomen we door
het magneetveld te kiezen voor een bepaalde EPR overgang (lijn in het EPR
spectrum) en de intensiteit van de invallende microgolfstraling te vergroten.
Hierdoor wordt de populatie in de twee niveaus A en D (zie figuur 1.4)
12
1.2. Resonantietechnieken: EPR en ENDOR
Figuur 1.4: Energieniveaus nodig voor ENDOR en in het geval
gN µN B.
|A0 |
2
>
nagenoeg gelijk en zal er geen netto microgolfabsorptie optreden.
Bij ENDOR volgen we deze absorptie van de microgolfstraling. In dit geval
(zonder radiofrequente bron) zullen we dus een constante absorptie waarnemen. Door een tweede stralingsbron in het radiofrequente (rf) gebied aan
te leggen, kunnen we NMR transities induceren. We laten de rf-frequentie
een voldoende groot gebied doorlopen. Bij bepaalde frequenties (bv. ν1
in figuur 1.4) worden de NMR transities gestimuleerd. Elektronen kunnen
via gestimuleerde emissie relaxeren via het NMR relaxatiepad. De EPR
transitie is niet langer gesatureerd, wat resulteert in een verandering van
de absorptie van de microgolfstraling. In de ENDOR plot komt een lijn
tevoorschijn.
Fysisch kunnen elektronen in toestand A (zie figuur 1.4) dankzij de gestimuleerde NMR transitie relaxeren naar toestand B (zie figuur 1.4). Vervolgens
kunnen ze relaxeren via het cross relaxatiepad naar de grondtoestand D (zie
figuur 1.4). In de grondtoestand kan het elektron terug geëxciteerd worden
door de microgolven naar toestand A (zie figuur 1.4). Steady-state ENDOR
heeft zijn naam te danken aan dit proces.
Analoog zal er bij de rf-frequentie ν2 in figuur 1.4 een tweede NMR overgang
geı̈nduceerd worden.
Protonen die zich ver van het ongepaarde elektron bevinden, zullen aan13
1.2. Resonantietechnieken: EPR en ENDOR
leiding geven tot een ENDOR lijn rond de frequentie voor een vrij proton.
Dit komt omdat protonen ver van het ongepaarde elektron voor een kleine
hyperfijnopsplitsing zorgen.
Uiteindelijk zullen twee lijnen te zien zijn op de ENDOR plot, alsook lijnen
rond de NMR frequentie van vrije protonen (ν0 in figuur 1.4).
1.2.5.2
Bepalen van de hyperfijninteractie uit ENDOR
Uit vgln. 1.32-1.35 kunnen we, voor een systeem met S = 12 , I = 12 en
rekening houdend met de selectieregels voor NMR overgangen (∆MS = 0
en |∆MI | = 1), de overgangsenergie berekenen :
∆E1 = E 1 1 ↔ E 1 − 1 =
2 2
2
2
∆E2 = E− 1 1 ↔ E− 1 − 1
2 2
2
2
A0
− g N µN B
2
A0
=
+ gN µN B
2
(1.62)
(1.63)
of
A0
− ν0 |
2h
A0
+ ν0 |
ν2 = |
2h
ν1 = |
(1.64)
(1.65)
met ν0 = gN µhN B de resonantiefrequentie van vrije kernen in het magnetisch
veld waarbij het ENDOR spectrum is gemeten.
Voor een sterke koppeling (|A0 | > |2gN µN B|) zijn er twee lijnen te zien in
2gN µN B
0
de ENDOR plot, symmetrisch rond | A
|. Dit is
2h | met opsplitsing |
h
het geval in figuur 1.4.
Met kennis van ν1 en ν2 kunnen we de hyperfijnkoppeling bepalen:
|
A0
| = ν2 + ν1 .
h
(1.66)
Alsook kunnen we een waarde voor gN berekenen uit:
|ν2 − ν1 | = 2ν0 =
2gN µN B
.
h
(1.67)
Voor een zwakke koppeling (|A0 | < |2gN µN B|) bekomen we twee lijnen,
symmetrisch rond | gN µhN B | met een opsplitsing van | Ah0 |.
14
1.2. Resonantietechnieken: EPR en ENDOR
De hyperfijnkoppeling bekomen we uit:
|
2A0
| = |ν1 − ν2 |.
h
(1.68)
Een waarde voor gN kunnen we berekenen uit:
ν2 + ν1 = 2ν0 =
15
2gN µN B
.
h
(1.69)
Hoofdstuk 2
De hyperfijnkoppeling
2.1
2.1.1
Theoretische interpretatie van de hyperfijnkoppeling
De anisotrope hyperfijnkoppeling
Klassiek kunnen we de energie voor de interactie tussen 2 magnetische momenten (~
µ1 en µ
~ 2 ) schrijven als [5]:
Edip = −
µ1 · ~r)(~
µ2 · ~r) µ
~1 · µ
~2
µ0 3(~
[
−
]
5
3
4π
r
r
(2.1)
Hier zijn de dipolen als punten beschouwd en is ~r de vector die de puntdipolen verbindt, µ0 de permeabiliteit van het vacuum en r = |~r|.
De overstap naar de kwantummechanica bestaat erin de magnetische momenten te vervangen door de corresponderende operatoren (vgln. 1.5 en
1.8):
~ˆ
µ
~ 1 →µ
~ˆS = −ge µB S
ˆ
µ
~ 2 →µ
~ˆN = gN µN I~
(2.2)
(2.3)
De hamiltoniaan wordt:
Ĥdip = gµB gN µN
~ˆ · ~r)(I~ˆ · ~r) S
~ˆ · I~ˆ
µ0 3(S
[
−
].
4π
r5
r3
(2.4)
Als we deze uitdrukking expanderen in cartesische coördinaten zien we dat
Ĥdip een tensorinteractie inhoudt die aan de oorsprong ligt van de anisotrope
16
2.1. Theoretische interpretatie van de hyperfijnkoppeling
hyperfijninteractie [9, 10]. We kunnen concluderen dat:
~ˆ · Ā¯dip · I~ˆ = Axx,aniso Ŝx Iˆx +Axy,aniso Ŝx Iˆy +...+Azz,aniso Ŝz Iˆz , (2.5)
Ĥdip = S
met (i, j = x, y, z):
µ0
3i2 − r2
ge gN µB µN
4π
r5
µ0
3ij
= ge gN µB µN 3
4π
r
Aii,aniso =
(2.6)
Aij,aniso
(2.7)
We kunnen de plaats van het elektron als de oorsprong van het assenstelsel
kiezen. Beschouw een interactie met een kern. De z-as kiezen we in de
richting van het proton en de afstand tussen het proton en het elektron is
z=r. Het proton heeft bijgevolg als coördinaten (0,0,r).
Nu kunnen we uit vgln. 2.6 en 2.7 de anisotrope hyperfijntensor berekenen:


Ā¯dip
−b 0 0




=  0 −b

0
0 2b
(2.8)
b=
µ0
ge gN µB µN .
4πr3
(2.9)
met
De waarde 2b correspondeert met de richting van het proton.
De puntdipoolbenadering is geldig als de afstand tussen het ongepaarde
elektron en het proton groot is vergeleken met de ruimtelijke distributie van
het elektron. Dit is het geval voor β-,γ-,...protonen (zie figuur 2.1 en sectie
2.1.3).
De puntdipoolbenadering kan verbeterd worden door de distributie van het
ongepaarde elektron in rekening te brengen en verwachtingswaarden te introduceren:
3i2 − r2
µ0
ggN µB µN h
i
4π
r5
µ0
3ij
= ggN µB µN h 3 i
4π
r
Aii,aniso =
(2.10)
Aij,aniso
(2.11)
In vgl. 2.5 is Ā¯dip de dipoolhyperfijnkoppeling of de anisotrope hyperfijn-
17
2.1. Theoretische interpretatie van de hyperfijnkoppeling
Figuur 2.1: Illustratie van α-, β-, en γ-protonen.
koppelingstensor gegeven door:

Ā¯dip

A
Axy,aniso Axz,aniso
 xx,aniso


=
Ayx,aniso Ayy,aniso Ayz,aniso 
Azx,aniso Azy,aniso Azz,aniso
(2.12)
zoals ze in vgl. 1.25 voorkomt.
2.1.2
De isotrope hyperfijnkoppeling
We kunnen vgl. 2.1 op een equivalente manier schrijven als:
Edip =
µ0 1 − 3cos2 θ
µN,z µS,z = Bloc µS,z
4π
r3
(2.13)
waarbij θ de hoek tussen het magnetisch veld (z-as) en de lijn die de twee
dipolen verbindt, r de afstand tussen de twee dipolen, en µN,z en µz de
componenten langs de z-as van de dipolen afkomstig van de kern en het
elektron respectievelijk. Bloc is de bijdrage aan het globaal magneetveld
van de kern op het elektron. Deze bijdrage kan tegengesteld of evenwijdig
met het globaal magneetveld zijn.
Het elektron is niet gelocaliseerd, maar uitgespreid over de ruimte. Om het
locaal magnetisch veld te berekenen, dient men Bloc uit te middelen over zijn
18
2.1. Theoretische interpretatie van de hyperfijnkoppeling
probabiliteitsdistributiefunctie. Als alle waarden voor θ even waarschijnlijk
zijn, zoals voor een elektron in een sferisch symmetrisch s-orbitaal, kan men
Bloc berekenen door vgl. 2.13 uit te middelen over een bol. Dit komt neer
op het berekenen van hcos 2 θi:
hcos 2 θi =
R 2π R π
0
cos 2 θ sin θ dθ dφ
1
=
3
0 sin θ dθ dφ
0
R 2π
Rπ
0
(2.14)
We zien dat Bloc verdwijnt in vgl. 2.13. Aangezien systemen met een
ongepaard elektron in een s-orbitaal experimenteel wel degelijk aanleiding
geven tot een isotrope hyperfijnkoppeling, is de klassieke manier niet afdoende om de isotrope hyperfijnopsplitsing te verklaren.
Een oplossing hiervoor komt uit de radiale distributie van s-orbitalen. Voor
een elektron in een s-orbitaal is er een eindige waarschijnlijkheid dat het
elektron zich bevindt op de kern. Het is deze eindige waarschijnlijkheid
die leidt tot het isotroop deel van de hyperfijninteractie. Aangezien p, d,
f,... orbitalen een nulpunt vertonen in de oorsprong (de positie van de
kern) kunnen enkel s-orbitalen (1s, 2s, 3s,...) aanleiding geven tot isotrope
hyperfijnopsplitsingen.
Volgens Fermi wordt de isotrope interactieparameter benaderend gegeven
door [11]:
2µ0
ge gN µB µN |ψ(0)|2
(2.15)
A0 =
3
met |ψ(0)|2 de probabiliteit op de kern en A0 de isotrope hyperfijnkoppelingsparameter zoals ze in vgl. 1.25 voorkomt.
2.1.3
2.1.3.1
Hyperfijnkoppeling van α-protonen
Isotrope hyperfijnkoppeling van het α-proton
Beschouwen we radicalen die opgebouwd zijn uit C-, O- en H-atomen en die
gevormd kunnen worden door bv. een H-atoom weg te nemen (bv. door
bestraling). Het achterblijvende ongepaarde elektron zal zich meestal in
een p-orbitaal van een C- of O-atoom bevinden. Een α-proton is een proton
gebonden aan het atoom met het ongepaarde elektron (zie figuur 2.1).
Beschouw een molecule met een ongepaard elektron in het 2pz -orbitaal van
een C-atoom. Het 2px -, 2py - en 2s-orbitaal van het C-atoom kunnen hybridiseren tot sp2 -orbitalen en elk sp2 gehybridiseerd orbitaal kan een σbinding met een ander atoom aangaan. In een vlakke conformatie zal het
19
2.1. Theoretische interpretatie van de hyperfijnkoppeling
Figuur 2.2: De polarisatie van de spin. Toestand I is energetisch voordeliger
en zal netto meer bijdragen dan toestand II [7].
2pz -orbitaal met het ongepaarde elektron loodrecht op de sp2 gehybridiseerde orbitalen staan. Het 2pz -orbitaal kan eventueel betrokken zijn in
een π-systeem van de molecule. Een p-orbitaal, en in het bijzonder het 2pz orbitaal, heeft een nodevlak loodrecht op de as van het p-orbitaal en door de
kern horende bij het orbitaal. De sp2 -gehybridiseerde orbitalen, en bijgevolg
ook de atomen gebonden via deze orbitalen, zullen in dit nodevlak liggen.
Aangezien de isotrope hyperfijnkoppeling afkomstig is van de probabiliteit
dat het ongepaarde elektron zich op een kern bevindt, kunnen de vermelde
kernen normaal geen aanleiding geven tot isotrope hyperfijnkoppeling.
Spectra tonen aan dat er wel degelijk een isotrope hyperfijnopsplitsing optreedt van α-protonen. Deze paradox komt er doordat we aannemen dat de
spin van het ongepaarde elektron de andere elektronen van de molecule niet
beı̈nvloedt. In realiteit treedt er correlatie tussen de spins op.
Beschouwen we bijvoorbeeld een C-H component van een radicaal met het
ongepaarde elektron in het 2pz -orbitaal van het C-atoom (zie figuur 2.2).
Het proton gaat een σ-binding aan met één van de gehybridiseerde orbitalen
van het C-atoom. Vanwege het Pauli-uitsluitingsprincipe hebben de elektronen van de σ-binding tegengestelde spin. Volgens de regel van Hund zullen
de spins van elektronen van een zelfde atoom bij voorkeur gelijk georiënteerd
zijn. Bijgevolg zullen de spins van het ongepaarde elektron en het elektron
in de σ-binding van het C-atoom bij voorkeur gelijk georiënteerd zijn. Anders gezegd: de probabiliteit dat deze twee spins gelijk georiënteerd zijn is
groter dan dat ze tegengesteld georiënteerd zijn.
20
2.1. Theoretische interpretatie van de hyperfijnkoppeling
Dit wil zeggen dat er zich een netto spindensiteit op het C-atoom bevindt die
tegengesteld is aan de netto spin van het elektron in de σ-binding van het Hatoom (zie figuur 2.2). Dit zal leiden tot een negatieve hyperfijnopsplitsing.
Dit effect heet spinpolarisatie en wordt beschreven door volgende formule:
aαiso = Qρπ
(2.16)
met ρπ de ongepaarde spindichtheid op de kern en een negatieve parameter Q, die een maat is voor de sterkte van deze interactie. Bovenstaande
vergelijking wordt de McConnell vergelijking genoemd [12, 13].
2.1.3.2
Anisotrope hyperfijnkoppeling van het α-proton
De anisotrope hyperfijninteractie heeft voor een planair radicaal met de lobe
van het ongepaarde elektron volgens de y-richting meestal volgend patroon:
(Adip,x , Adip,y , Adip,z ) = (+a, 0, −a)
(2.17)
Voor de drie hoofdwaarden hebben we:
-het maximum (a) voor de richting van het magnetisch veld evenwijdig aan
de α H-C binding,
-de middelste waarde (0) voor het magnetisch veld parallel met de loneelektron orbital (LEO)
-het minimum (-a) voor het magneetveld loodrecht op de LEO en de binding.
Indien de geometrie niet gekend is wordt het zeer moeilijk om de oriëntatie
van de lobe van het ongepaarde elektron te voorspellen en dient men beroep
te doen op simulaties met kwantumchemische berekeningen.
Gordy, en later Bernhard, stelden vast dat Adip,x het minst afhankelijk is
van de conformatie van het radicaal en stelden volgende relatie voor:
Adip,x = Qdip ρπ
(2.18)
met Qdip een empirische parameter. Zelfs voor relatief grote afwijkingen
van de vlakke conformatie (≤ 20◦ ) houdt deze vergelijking vrij goed stand.
Een typische waarde voor a in vgl. 2.17 is 20 MHz voor α-protonen in
sucrose [14].
21
2.1. Theoretische interpretatie van de hyperfijnkoppeling
2.1.4
Hyperfijnkoppeling van β-protonen
Uit experimenten blijkt dat de hyperfijnkoppelingen van β-protonen grotendeels isotroop zijn. Aangezien spinpolarisatieëffecten tweede orde effecten
zijn bij β-protonen, zullen zij een veel kleinere rol spelen.
Als we een H-atoom wegnemen uit een methaanmolecule (CH4 , bv. door
bestraling), ontstaat er een methylsysteem (ĊH3 ).
Beschouw een Ċ α − C β H3β fragment met het ongepaard elektron in een
2p-orbitaal van het C α -atoom. We kiezen de z-as in de richting van het
2p-orbitaal met het ongepaarde elektron (2pz ). De s-orbitalen van de H β atomen kunnen combineren tot een moleculair orbitaal met dezelfde symmetrieëigenschappen als een antisymmetrisch p-orbitaal. Als φa , φb en φc
de atoomorbitalen van de drie waterstofatomen zijn, kunnen ze een antisymmetrische lineaire combinatie maken tot een pseudo π-orbitaal. Een
voorbeeld van zo een combinatie is [9]:
ψ = c1 φa − c2 (φb + φc ) ≈ p0
(2.19)
met ψ het molecuulorbitaal en c1 en c2 normeringsconstanten (zie figuur
2.3).
Indien het pseudo π-orbitaal volgens de z-as ligt, kan dit een π-achtige
binding aangaan met het 2pz -orbitaal. Aangezien de kernen in het pseudo
π-orbitaal en bijgevolg in het π-systeem liggen, zal er zich een positieve spindensiteit op de H-kernen bevinden. Dit mechanisme heet hyperconjugatie
en is voornamelijk verantwoordelijk voor de isotrope hyperfijnkoppeling van
β-protonen.
Figuur 2.3: Schematische representatie van drie H-atomen die een moleculair orbitaal vormen (links) met dezelfde symmetrieëigenschappen als van
een p-orbitaal (rechts) [9].
22
2.2. Bespreking van de hyperfijninteractietensor
Heller en McConnell stelden volgende formule voor de isotrope hyperfijnkoppeling (aβiso ) voor [12, 15]:
aβiso = ρπ (B0 + B2 cos2 θ),
(2.20)
met θ de hoek tussen de LEO en de β H-C β binding en ρπ de spindensiteit
in het pz -orbitaal. B0 en B2 zijn empirische constanten. De tweede term
is maximaal als θ =0◦ en verdwijnt als θ=90◦ . De eerste term beschrijft de
spinpolarisatie.
De anisotrope hyperfijnkoppeling voor β-protonen is doorgaans niet groot.
In sectie 2.1.1 hebben we volgend patroon afgeleid: (-b, -b, 2b). Een typische
waarde voor b is 4 MHz voor een β-proton in sucrose ([14] en vb. in sectie
2.3).
2.1.5
Hyperfijnkoppeling van γ-, δ-,...protonen
ENDOR lijnen van verdere protonen kunnen we meestal vinden in het vrijeproton frequentiegebied (voor Q-band rond 51 MHz). Aangezien er zich in
dit gebied veel ENDOR lijnen bevinden, zullen deze doorgaans moeilijker
te onderscheiden zijn.
Verdere protonen hebben niet noodzakelijk een kleine isotrope hyperfijnkoppeling. Door grote spindelocalisatie en hogere orde spinpolarisatie kunnen
verdere protonen toch een aanzienlijke isotrope hyperfijnkoppeling veroorzaken. Een voorbeeld is te vinden in het suiker rhamnose [16].
2.2
2.2.1
Bespreking van de hyperfijninteractietensor
Bepaling van de hyperfijninteractietensor
In deze sectie verklaren we de structuur van de hyperfijninteractietensor
en hoe we deze kunnen bepalen uit EPR metingen. De procedure om de
hyperfijntensor te bepalen uit ENDOR metingen verloopt analoog.
We veronderstellen dat de elektronische Zeemaninteractie veel groter is dan
de nucleaire Zeemaninteractie waardoor we de nucleaire Zeemaninteractie
kunnen verwaarlozen.
De volledige spinhamiltoniaan heeft de volgende vorm (vgl. 1.11):
~ · ḡ¯ · S
~ˆ + S
~ˆ · Ā¯ · I~ˆ − gN µN B
~ · I.
~ˆ
Ĥspin = µB B
23
(2.21)
2.2. Bespreking van de hyperfijninteractietensor
We veronderstellen dat de g-tensor isotroop is en laten de nucleaire Zeemaninteractie achterwege. Meestal kennen we de oriëntatie van het kristal niet.
Daarom expanderen we deze hamiltoniaan in een willekeurig referentiestelsel
xyz [6, 9, 10]:
Ĥspin = gµB Bx Ŝx + gµB By Ŝy + gµB Bz Ŝz
+Ŝx Axx Iˆx + Ŝx Axy Iˆy + Ŝx Axz Iˆz
(2.22)
+Ŝy Ayx Iˆx + ... + Ŝz Azz Iˆz ,
~ˆ = (Sˆx , Sˆy , Sˆz ) en I~ˆ = (Iˆx , Iˆy , Iˆz )
~ = (Bx , By , Bz ), S
met B
We kiezen een nieuw referentiestelsel x’y’z’ waarbij z’ volgens de richting van
het magneetveld wordt gekozen. Nu is Bx0 = By0 = 0 en wordt de operator
Ŝ gekwantiseerd volgens de z’-as: Ŝz 0 . Als de richtingscoëfficiënten van x’y’z’
ten opzichte van xyz gegeven worden door respectievelijk (lx0 , mx0 , nx0 ),
(ly0 , my0 , ny0 ) en (lz 0 , mz 0 , nz 0 ), dan geldt:



Ŝ
l 0 ly0
 x  x
Ŝy  = m0 my0
   x
n x0 n y 0
Ŝz


Ŝ 0
lz 0
 x 


mz 0  Ŝy0 
.
Ŝz 0
nz 0
(2.23)
We substituteren 2.23 in 2.22. Termen horende bij de operator Ŝz zijn veel
groter dan termen horende bij de operatoren Ŝx of Ŝy . In deze eerste orde
benadering kunnen we deze niet-diagonaalelementen van de vorm Ŝx0 Axy Iˆy
verwaarlozen. We bekomen, rekening houdend met Bx0 = By0 = 0:
Ĥspin = gµB Bz 0 Ŝz 0 + lz 0 Ŝz 0 Axx Iˆx + lz 0 Ŝz 0 Axy Iˆy + lz 0 Ŝz 0 Axz Iˆz
+mz 0 Ŝz 0 Ayx Iˆx + mz 0 Ŝz 0 Ayy Iˆy + mz 0 Ŝz 0 Ayz Iˆz
(2.24)
+nz 0 Ŝz 0 Azx Iˆx + nz 0 Ŝz 0 Azy Iˆy + nz 0 Ŝz 0 Azz Iˆz .
We zien dat enkel de richtingscoëfficiënten van de z’-as overblijven. We
kunnen dus het subscript voor de richtingscoëfficiënten laten vallen. Ook
laten we het subscript van het magneetveld, dat volgens de z’-as ligt, vallen.
We maken gebruik van de volgende vereenvoudigende notatie:
Ax = lAxx + mAyx + nAzx
(2.25)
Ay = lAxy + mAyy + nAzy
(2.26)
Az = lAxz + mAyz + nAzz .
(2.27)
24
2.2. Bespreking van de hyperfijninteractietensor
We kunnen vgl. 2.24 herschrijven als:
Ĥspin = gµB B Ŝz 0 + Ŝz 0 Ax Iˆx + Ŝz 0 Ay Iˆy + Ŝz 0 Az Iˆz .
(2.28)
In wat volgt beschouwen we een systeem met S= 21 en I= 21 . Met behulp van
ladderoperatoren1 herschrijven we vgl. 2.28 als:
Ĥspin = gµB B Ŝz 0 + Ŝz 0 Ax (
Iˆ+ + Iˆ−
Iˆ− − Iˆ+
) + Ŝz 0 Ay (i
) + Ŝz 0 Az Iˆz . (2.30)
2
2
We rekenen het element h 21 12 | Ĥspin | 21 12 i uit:
11
11
| Ĥspin | i
22
22
11
Iˆ+ + Iˆ−
Iˆ− − Iˆ+
11
= h | gµB B Ŝz 0 + Ŝz 0 Ax (
) + Ŝz 0 Ay (i
) + Ŝz 0 Az Iˆz | i
22
2
2
22
(2.31)
1
1
= gµB B + Az ,
(2.32)
2
4
h
Uitrekenen van de term h 21 21 | Ĥspin | 12 − 12 i geeft:
1 1
11
| Ĥspin | − i
22
2 2
11
Iˆ+ + Iˆ−
Iˆ− − Iˆ+
1 1
= h | gµB B Ŝz 0 + Ŝz 0 Ax (
) + Ŝz 0 Ay (i
) + Ŝz 0 Az Iˆz | − i
22
2
2
2 2
(2.33)
Iˆ+
Iˆ+ 1 1
11
= h | Ŝz 0 Ax
− Ŝz 0 Ay i | − i
(2.34)
22
2
2 2 2
1
(2.35)
= (Ax − iAy ).
4
h
Als we op analoge manier de overige termen uitrekenen, kunnen we de vol1
Deze zijn gedefinieerd als:
Iˆ+
Iˆ−
= Iˆx + iIˆy
= Iˆx − iIˆy
25
(2.29)
2.2. Bespreking van de hyperfijninteractietensor
gende matrix construeren:
| 12 12 i
1
1
2 gµB B + 4 Az
1
4 (Ax + iAy )
0
0
| 21 − 12 i
|− 12 12 i
|− 12 − 21 i
1
h 12 12 |
0
0
4 (Ax − iAy )
1
1
1
1
h2 − 2|
0
0
2 gµB B − 4 Az
1
1
1
11
h− 2 2 |
0
− 2 gµB B − 4 Az − 4 (Ax − iAy )
1
1
h− 2 − 2 |
0
− 41 (Ax + iAy ) − 21 gµB B + 14 Az
(2.36)
Dit is de matrix van de spinhamiltoniaan in de basis |MS MI i.
We kunnen de eigenwaarden λ berekenen voor de bovenste blokmatrix
1 gµ B + 1 A − λ
2 B
4 z
1
(Ax + iAy )
4
1
4 (Ax
− iAy ) =0
1
1
2 gµB B − 4 Az − λ
g 2 µ2B B 2 R2
−
=0
4
16
(
λ1 = E1 = 12 gµB B + 14 R
⇔
λ2 = E2 = 12 gµB B − 14 R
⇔ λ2 − gµB Bλ +
(2.37)
(2.38)
(2.39)
q
met R= A2x + A2y + A2z .
Analoog bekomen we voor de onderste blokmatrix:
(
λ3 = E3 = − 12 gµB B + 41 R
λ4 = E4 = − 12 gµB B − 41 R
(2.40)
Baserend op 2.36 kunnen we stellen dat de eigenfuncties van volgende vorm
zullen zijn:
11
1 1
i + ci2 | − i , i = 1, 2
22
2 2
1 1
11
ψj = cj1 |− i + cj2 |− − i , j = 3, 4.
22
2 2
ψi = ci1 |
(2.41)
(2.42)
De seculiere vergelijking horende bij eigenwaarde E1 is:
1
1
1
( gµB B + Az )c11 + (Ax − iAy )c12 = E1 c11 ,
2
4
4
waaruit we bekomen:
c11
Ax − iAy
=
.
c12
R − Az
(2.43)
(2.44)
Samen met de normalisatievoorwaarde, |c11 |2 + |c12 |2 = 1, bekomen we
26
2.2. Bespreking van de hyperfijninteractietensor
uiteindelijk:
Ax − iAy
2R(R − Az )
R − Az
=p
2R(R − Az )
c11 = p
(2.45)
c12
(2.46)
en bijgevolg:
ψ1 = p
Ax − iAy
11
R − Az
1 1
| i+ p
| − i.
2R(R − Az ) 2 2
2R(R − Az ) 2 2
(2.47)
Op analoge manier kunnen we de overige eigenfuncties uitrekenen:
Ax − iAy
11
R + Az
1 1
| i− p
| − i
2R(R + Az ) 2 2
2R(R + Az ) 2 2
Ax − iAy
11
R + Az
1
ψ3 = p
|− i − p
|− −
2R(R + Az ) 2 2
2R(R + Az ) 2
Ax − iAy
R − Az
11
1
ψ4 = p
|− i + p
|− −
2R(R − Az ) 2 2
2R(R − Az ) 2
ψ2 = p
(2.48)
1
i
2
1
i.
2
(2.49)
(2.50)
EPR transities worden bekomen door elektromagnetische straling loodrecht
op de richting van het magneetveld te laten invallen op het radicaal. We
kunnen de overgangswaarschijnlijkheden berekenen door de verschillende
matrixelementen | hψi |Sx |ψj i |2 , met i = 1, 2 en j = 3, 4, uit te rekenen. We
bekomen, met Sx = S+ + S− en berekeningen analoog als deze in 2.31 en
2.33, volgende overgangswaarschijnlijkheden:
| hψ1 |S+ + S− |ψ4 i |2 = | hψ2 |S+ + S− |ψ3 i |2 = 1
2
2
| hψ1 |S+ + S− |ψ3 i | = | hψ2 |S+ + S− |ψ4 i | = 0
(2.51)
(2.52)
Bijgevolg zullen we 2 even intense lijnen in het EPR spectrum zien. De
opsplitsing tussen deze twee lijnen is, gebruikmakend van vgln. 2.39 en
2.40, evenredig met:
(E1 − E4 ) − (E2 − E3 ) = R,
(2.53)
wat afhankelijk is van de verschillende matrixelementen van de tensor en de
oriëntatie ten opzichte van het magneetveld.
q
We schrijven R= A2x + A2y + A2z volledig uit en we verzamelen de termen
27
2.2. Bespreking van de hyperfijninteractietensor
met dezelfde coëfficiënten:
R2 = A2x + A2y + A2z = l2 (A2xx + A2xy + A2xz ) + m2 (A2xy + A2yy + A2yz )
+ n2 (A2xz + A2yz + A2zz ) + 2lm(Axx Ayx + Axy Ayy + Axz Ayz )
+ 2ln(Axx Azx + Axy Azy + Axz Azz )
+ 2mn(Ayx Azx + Ayy Azy + Ayz Azz ),
(2.54)
wat we kunnen herschrijven als:
R=
q
l2 Txx + m2 Tyy + n2 Tzz + 2lmTxy + 2lnTxz + 2mnTyz ,
(2.55)
waarbij we de symmetrische tensor T̄¯ hebben ingevoerd als het kwadraat
van de Ā¯-tensor:

T
 


A
Axy Axz
A
Axy Axz
T
Txy Txz
 xx
  xx

 xx

¯





T̄ = Ayx Ayy Ayz  · Ayx Ayy Ayz  = Txy Tyy Tyz 
 . (2.56)
Azx Azy Azz
Azx Azy Azz
Txz Tyz Tzz
Uit vgl. 2.53 zien we dat de opsplitsing R de experimenteel gemeten grootheid is en vgln. 2.54-2.56 tonen dat we niet Ā¯ rechtstreeks meten, maar wel
het kwadraat van Ā¯. Dit betekent dat we niet rechtstreeks het teken van
de elementen van de hyperfijnkoppelingstensor Ā¯ kunnen bepalen.
We kunnen de elementen van het kwadraat van Ā¯, of T̄¯, bepalen. We
kiezen een referentieas loodrecht op het magneetveld en roteren rond deze
as. Stel dat deze referentieas de z-as is. De richtingscoëfficiënten van het
magneetveld zijn dan, met θ de hoek tussen de x-as en het magneetveld:
l = cos(θ), m = sin(θ), n = 0
(2.57)
en vgl. 2.55 wordt:
R(θ) =
q
Txx cos2 (θ) + Tyy sin2 (θ) + 2Txy sin(θ) cos(θ)
(2.58)
De waarden Txx en Tyy worden direct bekomen bij θ=0◦ en θ=90◦ . Om
Txy te berekenen kan men de waarde van R2 uitzetten in functie van θ
en vervolgens een sinusoı̈dale functie fitten via bv. de kleinste kwadraten
methode. Als men deze procedure herhaalt voor rotatie rond de x- en y-as,
kan men alle elementen van het kwadraat van Ā¯ bepalen.
De procedure voor ENDOR is analoog en een voorbeeld van een hoekafhan28
2.2. Bespreking van de hyperfijninteractietensor
Figuur 2.4: Een voorbeeld van een hoekafhankelijke ENDOR meting. De
lijn is een gefitte functie aan de meetpunten.
kelijke ENDOR meting is gegeven in figuur 2.4.
De volgende stap is het bepalen van de hoofdwaarden van T̄¯. De hoofdwaarden van de hyperfijnkoppelingstensor is de wortel uit de eigenwaarden
van T̄¯. De genormaliseerde eigenvectoren van deze tensor zijn de richtingscoëfficiënten van de hoofdrichtingen. Met de eigenvectoren als assenstelsel
wordt T̄¯ gediagonaliseerd met op de diagonaal de hoofdwaarden horende
bij de corresponderende eigenvector. Omdat we met het kwadraat van Ā¯
werken, kunnen we ook het teken van de hoofdwaarden niet direct bepalen.
Het is handiger om het kristal te beschrijven in een ander referentiestelsel
(vb. volgens de kristallografische a-, b- en c-as) dan het referentiestelsel dat
Ā¯ diagonaliseert (de eigenvectoren van Ā¯).
Hiervoor dienen we de diagonale Ā¯-tensor te transformeren. Als de richtingscoëfficiënten van de hoofdelementen AX , AY en AZ ten opzichte van een
willikeurig xyz-referentiestelsel respectievelijk (lX , mX , nX ), (lY , mY , nY ) en
(lZ , mZ , nZ ) zijn, dan is de gezochte transformatie:

l
X
 lY

lZ
mX
mY
mZ
 
nX
A
  X


nY  ·  0
nZ
0
0
AY
0
 
0
l
  X


0  · mX
AZ
nX
lY
mY
nY



lZ
A
Axy Axz

  xx


mZ  = Axy Ayy Ayz 
.
Axz Ayz Azz
nZ
(2.59)
29
2.2. Bespreking van de hyperfijninteractietensor
In het geval waar men de Ā¯-tensor in het kristallografische referentiestelsel
wil berekenen, zijn de richtingscoëfficiënten van de eigenvectoren (lX , mX , nX ),
(lY , mY , nY ) en (lZ , mZ , nZ ) deze ten opzichte van de respectievelijke kristallografische a-, b- en c-as.
Als laatste kan men het isotroop en het anisotroop deel van de gediagonaliseerde tensor scheiden. Aangezien het anisotroop deel van de hyperfijninteractietensor spoorloos is, wordt het isotroop deel gegeven door:
1
A0 = (AX + AY + AZ )
3
(2.60)
en de anisotrope componenten door:
(Adip,x , Adip,y , Adip,z ) = (AX − A0 , AY − A0 , AZ − A0 ).
2.2.2
(2.61)
Site splitting
Een kristal is opgebouwd uit eenheidscellen, die meestal zelf zijn opgebouwd
uit verschillende moleculen. Deze moleculen kunnen, binnen een eenheidscel, anders georiënteerd zijn ten opzichte van elkaar. Radicalen die chemisch
identiek zijn, kunnen bijgevolg anders georiënteerd zijn in een kristal, wat
resulteert in chemisch identieke, maar magnetisch verschillende radicalen.
Omdat de elektronische Zeemaninteractie en de hyperfijninteractie anisotroop zijn (geen g-factor maar een ḡ¯-tensor en een Ā¯-tensor), zal een verschil in oriëntatie een andere waarde voor de hyperfijninteractie geven. In
de ENDOR spectra resulteert dit in een opsplitsing van de lijnen, wat site
splitting wordt genoemd.
De positie en de oriëntatie van de moleculen binnen een eenheidscel zijn aan
elkaar gelinkt via de symmetrieoperaties van de symmetriegroep waartoe het
kristal behoort. De moleculen, en bijgevolg de radicalen, kunnen in elkaar
worden omgezet door de symmetrieoperaties van de symmetriegroep.
In deze masterproef wordt threonine bestudeerd. Een threoninekristal is
orthorombisch. Bij een orthorombisch kristal zijn de lengtes van de assen
verschillend, maar de assen maken onderling steeds een hoek van 90◦ .
Een orthorombisch kristal heeft 3 symmetrievlakken en bijgevolg 3 tweevoudige assen en 4 sites. Naast de eenheidsoperatie, heeft de orthorombische
30
2.2. Bespreking van de hyperfijninteractietensor
Figuur 2.5: Projectie van de plaatsvectoren van de 4 verschillende sites op
een kristallografisch belangrijk vlak (hier het ab-vlak). Sites I en III zijn
aan elkaar gelinkt door de tweevoudige rotatie c-as, net als sites II en IV.
symmetriegroep de volgende symmetrieoperaties:

 



−1 0 0
1 0
0
−1 0 0

 



 0 −1 0 , 0 −1 0  en  0 1 0  .

 



0
0 1
0 0 −1
0 0 −1
(2.62)
De niet-diagonaalelementen van de hyperfijnkoppelingstensoren voor de verschillende sites zullen numeriek dezelfde zijn, doch, het teken van de elementen kan verschillen. Voor een willekeurige oriëntatie van het kristal in
een magneetveld zullen er voor één interactie bijgevolg tot 4 ENDOR lijnen
te zien zijn.
De tweevoudige assen komen overeen met de a-, b- of c-as van het kristal.
Men kan roteren volgens één van de kristalassen (a-, b- of c-as) zodat het
magneetveld roteert in één van de kristallografische vlakken (respectievelijk
bc-, ac- of ab-vlak). Als voorbeeld kunnen we de projecties van de plaatsvectoren van de sites op het ab-vlak (rotatie c-as) bekijken (zie figuur 2.5). De
projectie van de plaatsvectoren van de sites die door de tweevoudige rotatieas (c-as) in elkaar worden omgezet (site I wordt omgezet in site III en
site II in site IV in figuur 2.5) zullen steeds dezelfde hoek maken met de richting van het magneetveld in het ab-vlak. Hierdoor worden ze paarsgewijs
magnetisch equivalent en treedt er site splitting in 2 op. Als het kristal zo
georiënteerd is zodat het magneetveld volgens een as gelegen is (a- of b-as
in figuur 2.5), maken de 4 plaatsvectoren van de sites dezelfde hoek met
de richting van het magneetveld en treedt er geen site splitting op. Site
splitting is bijgevolg zeer handig om de kristalassen, en dus de oriëntatie
van het kristal, te vinden via de spectra.
Ook kan site splitting informatie geven over de symmetriegroep van het
31
2.3. Voorbeeld: interactie van een ongepaard elektron met een proton in
fructose
kristal. Zo kan, voor een willekeurige oriëntatie van het kristal, een opsplitsing van de ENDOR lijnen in 4 wijzen op een orthorombische en een
opsplitsing in 2 op een monokliene kristalstructuur.
2.3
Voorbeeld: interactie van een ongepaard elektron met een proton in fructose
Als voorbeeld kan men een interactie van een ongepaard elektron met een
proton in fructose bestuderen [17]. De hoofdwaarden van de tensor van de
interactie zijn [103.54, 93.64, 92.19] MHz en de richtingscoëfficiëntenmatrix
ten opzichte van de kristallografische a-, b- en c-as is:


0.504 0.647
0.572


0.179 −0.726 0.664  .


0.845 −0.232 −0.482
(2.63)
Volgens vgl. 2.59 kunnen we we de Ā¯-tensor voor de eerste site in het
abc-assenstelsel construeren als volgt:
 
 


0.504 0.647
0.572
103.54
0
0
0.504 0.179
0.845

 

 


0.647 −0.726 −0.232 ·  0
93.64
0  · 0.179 −0.726 0.664 


 
0.845 −0.232 −0.482
0
0
92.19
0.572 0.664 −0.482


95.12 3.521 3.431


¯

= 3.521 97.66 3.487
 = Āsite1 .
3.431 3.487 95.58
(2.64)
Bij hoekafhankelijke ENDOR metingen kunnen we eerst rond de c-as roteren
van de a- naar de b-as, vervolgens kunnen we rond de a-as roteren van de
b- naar de c-as om tenslotte rond de b-as te roteren van de c- naar de aas. De simulatie, inclusief de nucleaire Zeemanterm, voor de eerste site is
weergegeven in figuur 2.6.
Aangezien de symmetrieoperaties de verschillende moleculen binnen een
eenheidscel in elkaar omzetten, kan men de Ā¯-tensor voor een tweede site
bekomen door de symmetrieoperaties 2.62 te laten inwerken op de rich-
32
2.3. Voorbeeld: interactie van een ongepaard elektron met een proton in
fructose
Figuur 2.6: Simulatie van een hoekafhankelijke ENDOR meting van een
interactie in sucrose voor de eerste site.
tingscoëfficiëntenmatrix (vgl. 2.63):
 

Lsite2

−1 0 0
0.504 0.647
0.572


 



= 0.179 −0.726 0.664  ·  0 −1 0

0
0 1
0.845 −0.232 −0.482
(2.65)
met Lsite2 de richtingscoëfficiëntenmatrix voor de tweede site. De Ā¯-tensor
voor de tweede site bekomen we door:

Ā¯site2

103.54
0
0


T
= Lsite2 · 
93.64
0 
 0
 · Lsite2
0
0
92.19

(2.66)

95.12
3.521 −3.431


=
97.66 −3.487
 3.521
.
−3.431 −3.487 95.58
(2.67)
De toegepaste symmetrieoperatie in vgl. 2.65 komt overeen met de operaties
(x,y,z)→(-x,-y,z) en wordt geı̈llustreerd in de overgang van tensor Ā¯site1 naar
Ā¯site2 . De symmetrieoperatie is een rotatie van 180◦ rond de z-as (in ons
stelsel is dit de c-as). De simulatie met deze tensor wordt weegegeven in
figuur 2.7.
Analoog kan men, door gebruik te maken van de twee overige symmetrie33
2.3. Voorbeeld: interactie van een ongepaard elektron met een proton in
fructose
Figuur 2.7: Simulatie van de hoekafhankelijke ENDOR metingen voor de
tweede site die bekomen werd via de symmetrieoperatie (x,y,z)→(-x,-y,z).
Figuur 2.8: Links: simulatie van de derde site bekomen door de symmetrieoperatie (x,y,z)→(x,-y,-z). Rechts: simulatie van de vierde site bekomen
door de symmetrieoperatie (x,y,z)→(-x,y,-z).
34
2.3. Voorbeeld: interactie van een ongepaard elektron met een proton in
fructose
operaties in vgl. 2.62 ((x,y,z)→(x,-y,-z), rotatie over 180◦ rond de x- of a-as
en (x,y,z)→(-x,y,-z), rotatie over 180◦ rond de y- of b-as), de Ā¯-tensoren
van respectievelijk site 3 en site 4 bepalen. De simulaties zijn weergegeven
in figuur 2.8.
Het bovenste luik van figuur 2.9 geeft een samenvatting van de 4 sites en
illustreert dat een ENDOR lijn opsplitst in 2 als het kristal zodanig georiënteerd is dat het magneetveld in een kristallografisch hoofdvlak (ab-, bcof ac-vlak) gelegen is en dat er geen site splitting optreedt wanneer het magneetveld volgens een kristalas gelegen is. Voor een willekeurige oriëntatie
(figuur 2.9 onderste luik, middelste figuur), waarbij het magneetveld niet
volgens een kristalas of in een hoofdvlak ligt, treedt er site splitting in 4 op.
In het voorbeeld in figuur 2.9 bedraagt de hoek tussen de rotatieas en de
a-as 10◦ .
Volgens vgl. 2.60 bedraagt het isotroop deel:
103.54 + 93.64 + 92.19
M Hz = 96.46M Hz
3
(2.68)
en volgens vgl. 2.61 is het anisotroop deel (7.08, −2.82, −4.27) MHz. Volgens sectie 2.1.1 correspondeert dit met de structuur van de hyperfijntensor
van een β-proton in de punt-dipoolbenadering.
35
2.3. Voorbeeld: interactie van een ongepaard elektron met een proton in
fructose
Figuur 2.9: Bovenste luik: samenvatting van de 4 sites. Onderste luik, midden: de hoek tussen de rotatieas en de a-as bedraagt 10◦ , met de rotatieas
in het ab-vlak, wat resulteert in een opsplitsing in 4.
36
Hoofdstuk 3
Inleiding tot aminozuren
3.1
3.1.1
Belang van aminozuren in het lichaam
Aminozuren, polypeptiden en proteı̈nen
Aminozuren zijn onmisbare bouwstenen voor het leven op aarde. Ze vervullen diverse biologische functies en zijn nodig voor de bouw van eiwitten,
of proteı̈nen, en peptiden.
Aminozuren worden gekenmerkt door een aminegroep (−N H2 ) en een carboxylgroep (−COOH). Indien de amine- en carboxylgroep aan hetzelfde
C-atoom gebonden zijn, spreekt men van een α-aminozuur met volgende algemene structuur: R−CH(N H2 )−COOH (zie figuur 3.1) [18]. R staat voor
residu- of restgroep. De aminegroep kan protoniseren terwijl de carboxylgroep kan deprotoniseren en de gevormde molecule wordt een zwitterion
genoemd met volgende structuur: R − CH(N H3+ ) − COO−
Indien de amine- en carboxylgroep niet aan hezelfde maar aan naast elkaar
gelegen C-atomen zijn gebonden, spreekt men van β-aminozuren. Analoog
bestaan er ook γ-, δ-,... aminozuren. Het C-atoom gebonden aan de aminegroep wordt het C α -atoom genoemd.
Daarnaast kan een aminozuur in verschillende stereo-isomeren voorkomen.
Stereo-isomeren hebben dezelfde chemische formule en verbindingen, maar
verschillen in ruimtelijke structuur en worden aangeduid met een letter (D-,
L-, DL-,...). Zo zijn bvb. D-aminozuren en L-aminozuren elkaars spiegelbeeld.
Alle α-aminozuren zijn, behalve glycine, optisch actief. Dit betekent dat
37
3.1. Belang van aminozuren in het lichaam
Figuur 3.1: De algemene structuur van een α-aminozuur.
bij doorgang van gepolariseerd licht door een aminozuur het polarisatievlak
over een bepaalde hoek is gedraaid.
Er worden slechts 22 aminozuren gebruikt bij de vorming van natuurlijke
polypeptiden. Deze worden de proteı̈nogenische of standaard aminozuren
genoemd. 8 standaard aminozuren zijn essentiëel. Ze kunnen niet door het
lichaam aangemaakt worden en dienen opgenomen te worden via het voedsel. Niet-essentiële aminozuren kunnen wel door het lichaam aangemaakt
worden indien nodig. In tabel 3.1 worden de 22 standaard aminozuren ingedeeld in essentiële en niet-essentiële [19].
Aminozuren hebben verschillende functies in het lichaam. Glycine bv. dient
o.a. als een neurotransmitter, arginine speelt een rol bij het functioneren
van de spieren en reguleert en ondersteunt het afweermechanisme, lysine is
nodig voor de groei, weefselherstel, de aanmaak van antilichamen, hormonen
en enzymen en verbetert de concentratie en alanine heeft een cholesterolverlagend effect. Veel aminozuren worden gebruikt als precursor voor andere
stoffen of spelen een rol in het metabolisme.
Proteı̈nen zijn polypeptiden die opgebouwd zijn uit de 22 proteı̈nogenische
aminozuren en zijn typisch tot honderden aminozuren lang.
3.1.2
Vorming van proteı̈nen uit aminozuren
De amine- en carboxylgroep van aminozuren kunnen met elkaar reageren
in een condensatiereactie met afsplitsing van water. In figuur 3.2 wordt bv.
de condensatiereactie van twee α-aminozuren met als restgroep R=CH3
(alanine) weergegeven. Een zuurstofatoom van de carboxylgroep van de
ene molecule reageert met twee waterstofatomen om water te vormen. Het
38
3.1. Belang van aminozuren in het lichaam
Essentiële aminozuren
Naam
Structuurformule
Niet-essentiële aminozuren
Naam
Structuurformule
Isoleucine
Alanine
Leucine
Asparagine
Lysine
Arginine
Methionine
Aspartinezuur
Phenylalanine
Cysteı̈ne
Threonine
Glutaminezuur
Tryptophaan
Glutamine
Valine
Glycine
Histidine
Proline
Serine
Tyrosine
Selenocysteı̈ne
Pyrrolysine
Tabel 3.1: De 22 proteı̈nogenische aminozuren ingedeeld volgens essentiële
en niet-essentiële [19].
39
3.1. Belang van aminozuren in het lichaam
Figuur 3.2: De vorming van een polypeptide door middel van een condensatiereactie tussen de amine- en carboxylgroep van een aminozuur.
stikstofatoom uit de aminegroep van de andere molecule en het overblijvende
H-atoom vormen een peptidebrug tussen de twee moleculen (zie figuur 3.2).
De gevormde molecule wordt een amine genoemd [20].
De amine heeft opnieuw een amine- en carboxylgroep die op hun beurt kunnen reageren. Verder aaneenrijgen van aminozuren zorgt voor de vorming
van peptiden, die we logischerwijze mono-, di-, tri-,.. peptiden noemen.
Het DNA (Desoxyribose Nucleic Acid) regelt de celhuishouding via het coderen van proteı̈nen. DNA bestaat uit twee lange strengen van nucleotiden
die in een dubbele helix rond elkaar zijn gerold. Elke nucleotide bestaat
uit een base, een fosfaatgroep en een desoxyribosegroep. De fosfaat- en de
desoxyribosegroepen vormen een lange streng en zijn het ’skelet’.
In DNA bevinden zich slechts 4 basen: guanine (G) , cytosine (C), adenine
(A) en thymine (T) die aan de suiker-fosfaatgroepen zijn gebonden. Via
baseparen, G C enerzijds en A T anderzijds, worden de twee strengen bij
elkaar gehouden.
Een deel van het DNA kan gekopieerd worden in de vorming van RNA (Ribose Nucleic Acid). Voor de vorming van proteı̈nen zijn messenger-RNA
(m-RNA), dat een serie codons bevat, en transfer-RNA (t-RNA) nodig.
Een codon (en een anticodon) bestaat uit een rij van drie basen. Iedere tRNA molecule bevat een anticodon en een bindplaats voor een aminozuur.
Verschillende t-RNA moleculen kunnen een verschillend codon bevatten en
corresponderende bij dit codon een verschillende bindplaats voor een aminozuur.
Het anticodon van de t-RNA molecule bindt op het passend codon van
het m-RNA. Het aminozuur wordt losgelaten en via een condensatiereactie
(zie figuur 3.2) gebonden aan een vorig aminozuur (zie figuur 3.3). Op het
volgende codon van de m-RNA molecule bindt zich het passende anticodon
van de corresponderende t-RNA molecule met het volgend aminozuur. Ook
dit aminozuur wordt aan de groeiende keten van aminozuren gehangen. Op
40
3.1. Belang van aminozuren in het lichaam
Figuur 3.3: De vorming van een eiwit uit aminozuren via m- en t-RNA [21].
deze manier groeit er een polypeptide (proteı̈ne) met een specifieke volgorde
van aminozuren en wordt het juiste eiwit gevormd [21].
Proteı̈nen hebben diverse belangrijke functies in het lichaam. Sommige
hebben een enzymatische functie bij de stofwisseling waarbij voedingsstoffen
omgezet worden in energie of bouwstoffen voor het lichaam. Andere kunnen
een rol spelen in de vorm, structuur of beweeglijkheid van de cellen. Zo
ondersteunen eiwitten het DNA tijdens DNA replicatie en verpakken ze het
DNA in een compacte structuur.
Proteı̈nen kunnen instaan voor communicatie binnen een cel (signaaleiwitten) en tussen cellen op afstand (hormonen), voor het transport van stoffen
in, uit en binnen een cel en hebben een regulerende functie door bvb. andere
eiwitten van vorm te veranderen.
Sommige eiwitten maken deel uit van eiwitcomplexen zoals hemoglobine,
dat instaat voor het transport van zuurstof via het bloed in het lichaam.
41
3.2. Straling en materie
3.2
3.2.1
Straling en materie
Straling
Straling is in het dagelijkse leven onmisbaar geworden. Enkele voorbeelden zijn communicatiesatellieten, microgolfovens, radiotherapie, zonnepanelen,... Men spreekt van straling als er energieoverdracht gebeurt door
elektromagnetische golven (vb. γ-straling) of deeltjes (vb. α- en β-straling)
zonder direct contact.
Er bestaat ioniserende en niet-ioniserende straling [22]. Bij ioniserende straling is de energie hoog genoeg om elektronen uit de moleculen of de atomen
te verwijderen. De overblijvende moleculen zijn elektrisch geladen (ionen).
Voorbeelden van ioniserende straling zijn hoogenergetische elektromagnetische γ- of X-straling, α- en β-straling.
Niet-ioniserende straling hebben onvoldoende energie om elektronen te verwijderen uit moleculen. De moleculen worden hoogstens geëxciteerd. Voorbeelden van niet-ioniserende straling zijn elektromagnetische golven in het
IR gebied, radiogolven, zichtbaar licht en microgolven.
Het verschil tussen X- en γ-stralen werd vroeger gemaakt op basis van de
energie van de straling, waarbij γ-straling een hogere energie dan X-stralen
had. Momenteel worden ze onderscheiden op basis van de manier waarop
de stralen worden geproduceerd. X-stralen onstaan uit transities van elektronen tussen elektronschillen in een atoom of molecule. γ-straling ontstaat
uit de kern van atomen, meestal uit het verval van de atoomkern.
3.2.2
Interactie van ioniserende straling met materie
Als men materie bestraalt, zullen er verschillende fysische processen optreden. Men neemt aan dat de intensiteit van de straling exponentieel afneemt
met de afstand die de straling in het medium aflegt. Men definieert de
dracht van de straling als de afstand in het medium waarbij de intensiteit
afgenomen is tot 1e van de oorspronkelijke intensiteit. De dracht van αdeeltjes met energie 10 MeV is van de orde 10 - 100 µm. Van β- deeltjes
met 10 MeV energie is dit van de orde tussen millimeters en centimeters
en van 10 MeV γ-straling is dit ongeveer 20 cm [22]. Elektromagnetische
straling kan interageren met materie door o.a. absorptie en verstrooiı̈ng.
Een eerste interactiemechanisme is het foto-elektrisch effect. Hierbij wordt
het invallend foton volledig geabsorbeerd door een elektron. Indien de ener42
3.2. Straling en materie
Figuur 3.4: Verschillende interactiemechanismen tussen een foton en een
elektron. Links het foto-elektrisch effect, midden het comptoneffect en
rechts elektron-positron paarvorming.
gie van het foton voldoende hoog is, zal het foto-elektron, dit is het elektron
dat het foton absorbeert, gescheiden worden van de molecule of het atoom
(zie figuur 3.4). Het foto-elektrisch effect is het dominant interactiemechanisme bij energieën van 1 tot 500 keV.
In een tweede reactiemechanisme kan een foton verstrooien aan een elektron
in het comptoneffect. Het interagerend elektron wordt uit zijn baan rond
het atoom geslagen (zie figuur 3.4). Een deel van de energie van het foton
wordt hierbij overgedragen op het elektron waardoor het verstrooide foton
een iets grotere golflengte krijgt. Er treedt een roodverschuiving van het
foton op. Het comptoneffect is het dominante interactiemechanisme bij
energieën rond 1 MeV.
Een derde mechanisme is elektron-positron paarvorming. Wanneer de fotonen meer energie bezitten dan het dubbele van de rustmassa van een
elektron (511 keV), kan het foton omgezet worden in een elektron-positron
paar (zie figuur 3.4). Dit mechanisme treedt op vanaf Ef oton > 1.02 MeV.
De omzetting gebeurt meestal in de buurt van een kern. Het positron interageert meestal snel met een elektron waarbij twee fotonen van minimum
511 keV worden gevormd.
Bij de meeste interactiemechanismen ontstaat er een secundair elektron.
Dit secundair elektron kan voldoende energie bezitten om op zijn beurt
secundaire elektronen, met lagere energie dan het oorspronkelijke elektron,
los te slaan. Dit fenomeen wordt δ-straling genoemd en is verantwoordelijk
voor ongeveer 25% van de ionisaties in materie [22].
De lineaire energieoverdracht (Lineair Energy Transfer, LET) is een maat
voor de energie van de straling die per lengte-eenheid wordt overgedragen
op de materie, meestal uitgedrukt in keV/µm. Straling met een hoge LET
43
3.2. Straling en materie
waarde, zoals α-straling of zware ionen, zullen ionisaties veroorzaken die
relatief dicht bij elkaar zijn gelegen. Ook secundaire ionisaties gebeuren
bijgevolg dicht bij elkaar. Dit zorgt voor een relatief aanzienlijke schade
langs het ionisatiepad van de primaire stralenbundel.
Straling met een lage LET waarde, zoals γ- en β-straling, veroorzaken primaire en secundaire ionisaties die relatief verder van elkaar zijn verwijderd.
Hierdoor is de energieoverdracht, en de toegebrachte schade, meer homogeen
verspreid in de ruimte en bijgevolg minder schadelijk.
Voor deze masterthesis wordt gebruik gemaakt van X-stralen met een energie van ongeveer 60 keV om de kristallen te bestralen (zie sectie 4.2.2),
waardoor het foto-elektrisch effect het dominante interactiemechanisme is.
3.2.3
Vorming van radicalen
Een radicaal is een molecule met een ongepaard elektron. Ioniserende elektromagnetische straling kan direct geabsorbeerd worden door een molecule.
Hierbij wordt, via het foto-elektrisch effect, een elektron gescheiden van een
molecule in de vorming van een (positief geladen) kation en een elektron
in een oxidatieproces. Een veel voorkomend primair oxidatieproduct van
aminozuren is afkomstig van decarboxylatie van het zwitterion [23, 24]:
R − CH(N H3+ ) − COO− → R − CH(N H3+ ) − ĊOO + e− .
(3.1)
Het foto-elektron zal energie verliezen door secundaire excitaties en ionisaties. Na voldoende energie verloren te hebben kan het elektron recombineren met een geoxideerde molecule in de vorming van een diamagnetische molecule, gevangen raken tussen moleculen of gebonden worden aan
een andere intacte molecule in een reductieproces.
Bij secundaire elektronen interageert de straling niet direct met moleculen
maar dringen de gevormde elektronen en gaten door in de materie om daar
te interageren met moleculen. De straling heeft dan een indirect effect.
Elekronen en gaten zullen zich preferentieel binden op atomen met respectievelijk een hoge elektronenaffiniteit en een lage ionisatiepotentiaal.
Een veel voorkomend primair reductieproduct van aminozuren door bestraling kan gevormd worden door een elektron te binden aan de carboxylgroep
[23]:
R − CH(N H3+ ) − COO− + e− → R − CH(N H3+ ) − ĊOO2− .
44
(3.2)
3.2. Straling en materie
Meestal zijn de primair gevormde kat- en anionen instabiel. Voor een een gas
of vloeistof zijn deze ionen mobiel en kunnen ze migreren door het materiaal.
Er kunnen ladingsoverdrachten plaatsvinden via (de)protonisatie, dit zijn
overdrachten van protonen (H-kernen) tussen moleculen, of de radicalen
kunnen chemisch reageren tot een diamagnetisch eindproduct of een stabiel
secundair radicaal (al dan niet geladen).
Een voorbeeld van de vorming van een secundair radicaal in aminozuren
gebeurt bij deaminatie van het gereduceerd aminozuur in 3.2 [23]:
R − CH(N H3+ ) − ĊOO2− → R − ĊH − COO− + N H3 .
3.2.4
(3.3)
Toepassingen van EMR op bestraalde biomoleculen
Organische moleculen zijn doorgaans diamagnetisch. Na oxidatie of reductie krijgen ze een ongepaard elektron met de vorming van radicalen. De
paramagnetische radicalen kunnen, als ze voldoende stabiel zijn, bestudeerd
worden met Elektronen Magnetische Resonantie (EMR) technieken.
Er zijn verscheidene toepassingen van EMR technieken. Bij EPR dosimetrie
probeert men de dosis geabsorbeerde straling van een sample te achterhalen
(vb. [25]). Bij een goede dosimeter is de gevoeligheid voor de straling hoog
en zijn de stralingsgeı̈nduceerde radicalen stabiel. Alanine is een voorbeeld
van een goede dosimeter. Bij bestraling ontstaan er voldoende radicalen die
lang stabiel blijven waardoor het EPR signaal niet snel vervaagt.
Een voorbeeld van EPR dosimetrie in het dagelijks leven komt uit de voedingsindustrie. Voedsel kan worden bestraald om o.a. bacteriën en schimmels te doden om zo langer bewaard te kunnen worden. Aan de hand van
EPR dosimetrie kan men bepalen als voedsel al dan niet bestraald is geweest, wat belangrijk is voor de volksgezondheid.
EPR datering is een vorm van dosimetrie waar men een schatting maakt van
de leeftijd van het te onderzoeken sample. Hierbij gaat men ervan uit dat
alle voorwerpen voortdurend blootgesteld worden aan natuurlijke straling.
De natuurlijke straling is grotendeels afkomstig van kosmische straling of
straling uit verval van elementen uit de omliggende natuur (vb. 238 U, 232 Th
en 40 K).
Daarnaast worden EMR technieken gebruikt in het fundamenteel onderzoek
naar o.a. stralingsgeı̈nduceerde radicalen. Bij het fundamenteel onderzoek
45
3.3. Belang van threonine
Figuur 3.5: Het EPR spectrum van verschillende aminozuren een kwartier
na bestraling. Voor methionine is dit een half uur na bestraling [26].
worden o.a. de structuren van radicalen in diverse stoffen (suikers, aminozuren,...) bepaald en worden deze met elkaar vergeleken. Zo probeert
men o.a. te achterhalen welke en waarom bepaalde radicalen al dan niet
gevormd worden en kan men proberen om de stralingseffecten op grotere
bio-moleculen, zoals proteı̈nen waarvan aminozuren de bouwstenen zijn, te
bestuderen.
3.3
Belang van threonine
3.3.1
Threonine als dosimeter
In een vorige studie is de stabiliteit van het EPR signaal van verschillende
essentiële aminozuren bestudeerd [26]. In figuur 3.5 worden de EPR spectra
weergegeven van leucine, phenylalanine, tryptophaan, threonine, isoleucine,
valine, methionine en lysine een kwartier (voor methionine 30 minuten)
na bestraling met X-stralen bij kamertemperatuur (KT). Methionine en
tryptophaan geven geen of nauwelijks EPR signaal waardoor ze niet kunnen
worden bestudeerd. Hierdoor zijn ze niet bruikbaar als dosimeter.
Threonine bleek de beste kandidaat dosimeter te zijn. Het EPR spectrum
verandert niet van een kwartier tot minimum 3 maanden na bestraling (zie
46
3.3. Belang van threonine
Figuur 3.6: EPR spectra van threonine van een kwartier tot 3 maanden na
bestraling [26].
figuur 3.6). Men kan goed bruikbare threoninekristallen groeien.
3.3.2
Biologisch belang van threonine
Threonine is een essentieel aminozuur dat van biologisch belang is bij haargroei en het doorgeven van signalen binnen een cel (signaaltransductie). Ook
is het aanwezig in verschillende proteı̈nen zoals in eieren, insuline, gelatine,
γ-globuline en hemoglobine.
Het is belangrijk om het effect van straling op biologische moleculen zoals
aminozuren, proteı̈nen en eiwitcomplexen, en het gevolg voor de organismen
te bestuderen. De straling kan afkomstig zijn uit de natuur, maar ook van
medische toepassingen zoals X-stralen fotografie, CT-scan, radiotherapie
voor kanker, ... [22]
Door inzicht te krijgen in de vorming en de structuur van stralingsgeı̈nduceerde radicalen in threonine en aminozuren in het algemeen, kunnen we
een beeld proberen vormen van hoe straling interageert met aminozuren en
kunnen we proberen om aminozuren als modelsysteem voor proteı̈nen en
eiwitcomplexen te beschouwen.
Toch zijn er een paar problemen wanneer men aminozuren als bouwstenen
47
3.4. Literatuurstudie: alanine en glycine
voor eiwitten beschouwt. De structuur van vrije aminozuren kan sterk verschillen van de structuur van aminozuren in een verbinding. Ook kunnen
radicalen, gevormd na bestraling, in vrije aminozuren of aminozuren in een
verbinding sterk verschillen.
3.4
Literatuurstudie: alanine en glycine
Belangrijke pioniers voor het werk over aminozuren is verricht door o.a.
Gordy, Morton en Miyagawa et al [27]-[29]. De meest eenvoudige aminozuren zijn alanine (R=CH3 ) en glycine (R=H). Over alanine is het meest
geschreven. Over glycine bestaat er in mindere mate literatuur.
In dergelijke EMR studies worden beide aminozuren bestraald met X- of
γ-stralen bij temperaturen gaande van 4 K tot 300 K met de vorming van
radicalen tot gevolg. Deze laatste lenen zich uitstekend voor EMR metingen.
De vormingsprocessen voor radicalen in moleculen zijn vrij complex en voor
aminozuren worden deze hoofdzakelijk bepaald door de uiterste carboxylen aminegroep.
3.4.1
Glycine
Het aminozuur glycine (H3 N + CH2 COO− ) kan door het lichaam aangemaakt worden.
Na bestraling met X-stralen zijn er 5 radicalen die stabiel zijn bij KT geidentificeerd. Radicaal RI, met structuur N H3+ ĊHCOO− , en radicaal RII,
met structuur ĊH2 COOH, zijn het eerst ontdekt [29, 30].
Later werden radicaal RIII, met structuur N H2 ĊHCOOH, radicaal RIV,
dat dezelfde chemische structuur als radicaal RIII heeft maar een andere
geometrische conformatie, en radicaal RV, met structuurformule H2 N CH2 COĊHCOOH, gevonden [31, 32]. Radicaal RV is opgebouwd uit 2 moleculen.
3.4.1.1
Vormingsmechanismen
Voor een algemene beschrijving van vormingsmechanismen van radicalen
kan men verwijzen naar sectie 3.2.3.
48
3.4. Literatuurstudie: alanine en glycine
Figuur 3.7: (a) Het vormingsmechanisme van radicalen RI en RII startend
van het gereduceerd radicaal op de carboxylgroep en (b) van radicalen RI,
RIII en RIV startend van het geoxydeerd radicaal op de carboxylgroep in
glycine [24].
In figuur 3.7 (a) staat een eenvoudig mechanisme dat leidt tot de vorming
van radicalen RI en RII. Het radicaal g1a (zie figuur 3.7), gevormd na bestraling en geobserveerd bij 77 K, is gerapporteerd in verschillende EMR
publicaties [33]-[35], maar eerst door Collins en Whiffen [36]. Eerst wordt
de carboxylgroep geprotoniseerd waarbij radicaal g2a (zie figuur 3.7) wordt
gevormd, voorgesteld door Iwasaki en Muto [33]. Na annealing tot 140 K
reageert dit radicaal volledig weg door afspliting van de aminegroep in de
vorming van raidcaal RII [37]. In een intermoleculaire reactie wordt een
deel van deze gevormde radicalen omgevormd tot radicaal RI, zoals geobserveerd door Morton [29]. In een recente studie gebruikt men de structuur
van radicaal RI voor DFT berekeningen van vibrationele modes, met grote
overeenkomst met experimenten tot gevolg [38]. Dit bevestigt voorlopig de
correctheid van de voorgestelde structuur van radicaal RI.
Voor de vorming van radicalen RIII en RIV is een complexer mechanisme
49
3.4. Literatuurstudie: alanine en glycine
Figuur 3.8: Het vormingsmechanisme radicaal RV in glycine [24].
nodig. Dit mechanisme wordt weergegeven in figuur 3.7 (b). Het radicaal
g1c (zie figuur 3.7) is nooit geobserveerd. Men neemt aan dat het een
amineproton afsplitst in de vorming van radicaal g2c, geobserveerd bij 4.2
K door Nunome et al [39], waar duidelijk een interactie met een 14 N -kern
staat beschreven. Daarna verandert het radicaal van een C- naar een Ngecentreerd radicaal: g3c door annealing tot 110 K, het eerst geobserveerd
door Sinclair [40].
Dit radicaal kan ofwel reageren via een intramoleculaire reactie waarbij er
een proton wordt herschikt en het radicaal RI wordt gevormd [41], ofwel
via een tussenstap, waarbij eerst de carboxylgroep wordt afgestoten in de
vorming van het radicaal g6c om vervolgens via een intermoleculaire reactie
tot RI te transformeren [40]. Het intermediaire radicaal g6c is nooit met
zekerheid in een vaste stof gedetecteerd, wel in oplossing.
Het N-gecentreerd radicaal (g3c, zie figuur 3.7) kan via een andere manier
reageren door afsplitsing van een proton naar g4c [42]. Vervolgens reageert
het verder door protonisatie van de carboxylgroep naar radicalen RIII en
RIV.
De vorming van het samengesteld radicaal V wordt weergegeven in figuur
3.8. Hierbij reageert een radicaal dat de aminegroep heeft afgestoten met
een een glycinemolecule met afsplitsing van water.
Naast radicaal g2c (zie figuur 3.7) zijn er nog radicalen waar er een interactie
met het 14 N -atoom is geobserveerd [29, 36, 39]. Een samenvatting van de
gevormde en geobserveerde radicalen in glycine bij verschillende temperaturen is weergegeven in tabel 3.2.
3.4.2
Alanine
Alanine kan als een α- of een β-aminozuur voorkomen. Daarnaast zijn er
voor bv. het α-alanine nog verschillende stereoisomeren: L-α-alanine (zie
50
3.4. Literatuurstudie: alanine en glycine
Tabel 3.2: Samenvatting van de gevormde radicalen geobserveerd bij verschillende temperaturen in glycine.
4.2 K
77 K
110 K
KT
Figuur 3.9: De structuurformule van L-α-alanine.
figuur 3.9), D-α-alanine en DL-α-alanine. Meestal laat men de α in de
naamgeving eenvoudigheidshalve vallen. D-alanine kan enkel synthetisch
vervaardigd worden en is het spiegelbeeld van L-alanine. L-alanine kan in
het lichaam aangemaakt worden. De methylgroep in alanine kan bij KT
snel roteren met een activatieënergie van 23.4 kJ/mol.
De radicalen in alanine zijn uitvoerig met EMR metingen bestudeerd. Lange
tijd heeft men aangenomen dat er slechts één enkel stabiel alanine radicaal
(SAR) bij KT met structuur H3 C ĊHCOOH werd gevormd. Deze bleek
niet correct en een nieuwe structuur N H4+ ĊH(CH3 )COO− , die in wat
volgt radicaal R1 wordt genoemd, werd voorgesteld [43].
Er werd ook nog een tweede stabiel radicaal R2 met structuur N H3+ Ċ(CH3 )COO− gevonden [44, 45]. De lijnen van radicaal R2 zijn veel minder
intens dan deze van radicaal R1. Simulaties hebben aangetoond dat de
relatieve distributie 60%:40% bedraagt [44]. Dit kan gevolgen hebben voor
de bruikbaarheid van alanine als dosimeter.
In dezelfde studie werd nog een derde radicaal R3 gevonden met structuur N H2 ĊCH3 COO(H) en radicaal R4, chemisch identiek aan radicaal
R3 maar een andere conformatie. Naast radicaal R1 zijn ook radicalen
R2-R4 stabiel bij KT.
51
3.4. Literatuurstudie: alanine en glycine
Figuur 3.10: (a) Een alaninemolecule in zwitterionische vorm en (b) het
alanineradicaal R1.
3.4.2.1
Vormingsmechanisme van de radicalen
De vormingsmechanismen voor radicalen in alanine zijn gelijkaardig aan
deze in glycine, met vervanging van de restgroep H → CH3 . Voor het
vormingsmechanisme van radicaal R1 vertrekt men van het reductieproduct H3 N + CH(CH3 )ĊOO2− . De C-N binding wordt uitgerekt en er treedt
een proton transfer van een alaninemolecule verder weg in het kristal naar
de N H3 groep op waarbij een N H4+ molecule wordt afgesplitst. Het getransfereerde proton is waarschijnlijk afkomstig van deprotonisatie van een
geoxideerd alanineradicaal. De positieve afgesplitste N H4+ molecule blijft
in de buurt van het negatief geladen radicaal om een neutraal systeem te
vormen. De DFT berekeningen, waarbij het extra H-atoom op de aminegroep een effect op de Cα − Hα binding heeft, zijn in goede overeenkomst
met experimentele waarden van Sagstuen et al. [43, 44]. Het gevormde
radicaal lijkt op de zwitterionische vorm van alanine (zie figuur 3.10) wat
een verklaring kan zijn voor de grote stabiliteit van het radicaal.
Ook het gereduceerde radicaal, gevormd na bestraling bij 77 K en met
protonisatie de carboxylgroep H3 N + CH(CH3 )ĊO− OH, is gedetecteerd bij
dezelfde temperatuur [46, 47].
De vorming van de overige radicalen (R2, R3 en R4 met R4 een andere conformatie van R3) is weergegeven in figuur 3.11. het geoxideerde carboxylgecentreerd radicaal a1c (zie figuur 3.11). splitst een proton af van de aminegroep en wordt a2c, geobserveerd bij 77 tot 80 K [48, 49].
Na annealing kan het radicaal ofwel reageren door de carboxylgroep af te
splitsen (a5c, niet geobserveerd in vaste stof) en vorvolgens via een intermoleculaire reactie (H transfer) resulteren in het radicaal R2 [44], ofwel
door deprotonisatie in de vorming van het radicaal a3c en vorvolgens na
protonisatie van de carboxylgroep naar het radicaal R3 of R4 [44].
52
3.4. Literatuurstudie: alanine en glycine
Figuur 3.11: Het vormingsmechanisme van het radicalen R2 en R3 in alanine.
Tabel 3.3: Samenvatting van de geobserveerde radicalen in alanine bij verschillende temperaturen.
77-80 K
KT
53
3.4. Literatuurstudie: alanine en glycine
Figuur 3.12: Gelijkenissen in de vormingsmechanismen van de radicalen in
glycine en alanine.
Bij de studie van de radicalen in aminozuren is het interessant de vormingsmechanismen van alanine en glycine te vergelijken. Er zijn bepaalde gelijkenissen gevonden zoals deprotonisatie van de aminegroep, protonisatie of
afsplitsing van de carboxylgroep, deprotonisatie van het Cα -atoom (gebonden aan de aminegroep), ... In figuur 3.12 wordt een schema voor eventueel
mogelijke reactiepaden gegeven.
Voor de vorming van radicaal R1 in alanine, waar gestart wordt van het
gereduceerd product (anion tak in figuur 3.12) en waar de aminegroep extra
geprotoniseerd wordt, is een meer complex schema nodig. Ook voor radicaal
RV in glycine, waar een extra glycine molecule nodig is voor de vorming van
het radicaal, is een alternatief schema nodig.
3.4.2.2
Bespreking van radicaal R1 in alanine
Om aan te tonen dat het ongepaard elektron vooral interageert met de protonen uit de methylgroep en het α-proton, hebben Miyagawa en Itoh EPR
experimenten uitgevoerd met L-alanine in gedeutereerd water [27]. In dit
experiment werden de waterstofatomen gebonden aan N en O gesubstitueerd
met deuterium:
L − CH3 CH(N H2 )COOH → L − CH3 CH(N D2 )COOD.
(3.4)
Aangezien deuterium spin 1 heeft, zal er een significant verschil zijn in
54
3.4. Literatuurstudie: alanine en glycine
de EPR spectra van een ongepaard elektron dat interageert met protonen of met deuteronen. De EPR spectra van radicalen in gedeutereerd
alanine toont evenveel, maar nauwere lijnen als in niet gedeutereerd alanine. Dit toont aan dat de grote interacties afkomstig zijn van de protonen
in de methylgroep en het α-proton. De verbreding van de lijnen in niet
gedeutereerd alanine is het gevolg van interacties van verdere, uitwisselbare
(exchangeable) protonen.
Bij KT kunnen de waterstofatomen van de methylgroep (Hβ1 , Hβ2 en Hβ3 )
snel roteren om de C α − C β as. Hierdoor worden ze equivalent en wordt
het EPR spectrum sterk vereenvoudigd [28]. In tabellen 3.4 en 3.5 worden
de opsplitsingen ten gevolge van de drie β-protonen van de methylgroep en
het α-proton weergegeven bij respectievelijk 77 K en 293 K.
De relatieve intensiteit van de absorptielijnen voor 3 equivalente protonen
verhouden zich als 1:3:3:1 met equidistante absorptielijnen in het EPR spectrum. De anisotropie van deze interactie is relatief klein (10%), wat in
overeenstemming is met de aard van de β-protonen. Het α-proton splitst
de lijnen van het spectrum verder op en deze hyperfijninteractie is veel
anisotroper. Het anisotroop karakter van de interacties van de verschillende
waterstofatomen kan worden afgeleid uit de eigenwaarden van de corresponderende A-tensoren [27].
Indien het EPR spectrum gemeten wordt met het magneetveld langs de
[100] of [010] as van het kristal, dan is het spectrum telkens een kwartet
met een doubletstructuur. De relatieve verhoudingen van de intensiteit zijn
1:1:3:3:3:3:1:1. Dit komt overeen met twee gesuperponeerde 1:3:3:1 kwartetten en is het gevolg van 3 methylequivalente protonen met één inequivalent
proton. Bij meting van het spectrum met het magneetveld langs de [001] as
van het kristal bekomen we een kwintet met relatieve intensiteit 1:4:6:4:1,
als gevolg van 4 equivalente protonen.
Bij lage temperatuur verandert het EPR spectrum aanzienlijk omdat de
drie β-protonen niet langer equivalent zijn. Dit kan verklaard worden door
de methylgroep die niet meer roteert rond de Cα − C β as. Dit zorgt ervoor
dat het spectrum bij lage temperatuur complexer is (zie figuur 3.13).
De equivalentie van het α-proton en de drie β-protonen wanneer het magneetveld gelegen is langs de [001] as bij 293 K is louter toevallig (zie tabel
3.5). Merk op dat het gemiddelde van de hoofdwaarden van de hyperfijninteracties van de 3 β-protonen bij 77K sterk overeenkomt met de hoofdwaarden van de β-protonen bij 293 K, wat erop wijst dat de hyperfijninteractie
55
3.4. Literatuurstudie: alanine en glycine
Tabel 3.4: De hyperfijnkoppelingsconstanten langs de hoofdassen van het
kristal bij 77 K in alanine. De waarden voor AI , AII , AIII en Agem zijn
voor de protonen in de methylgroep. De waarden voor AIV zijn voor het
α-proton. Agem is het gemiddelde van AI , AII en AIII . [27]
Richting AI (mT) AII (mT) AIII (mT) Agem (mT) AIV (mT)
[100]
0.44
2.81
4.16
2.47
1.83
[010]
0.64
2.76
4.21
2.54
2.12
[001]
0.51
2.76
4.61
2.62
2.76
Tabel 3.5: De hyperfijnkoppelingsconstanten langs de hoofdassen van het
kristal bij 293 K in alanine. De waarden Agem zijn voor de protonen in de
methylgroep. De waarden voor AIV zijn voor het α-proton. [27]
Richting Agem (mT) AIV (mT)
[100]
2.45
1.88
[010]
2.54
1.99
[001]
2.63
2.63
van de 3 protonen bij lage temperatuur uitgemiddeld wordt door de rotatie
van de methylgroep bij hoge temperatuur.
In het bovenste luik van figuur 3.13 wordt de evolutie van de energieniveaus
van 77 K naar 293 K geschetst voor het magneetveld langs de [001] as. In de
figuur worden de toestanden aangegeven door middel van het teken van de
magnetische spin mβ1 , mβ2 en mβ3 van de β-protonen in de methylgroep.
Deze kunnen de waarde ± 12 aannemen. In het onderste luik van figuur
3.13 wordt het EPR spectrum bij 18 K en 293 K weergegeven met het
magneetveld in de richting van de [001] as.
56
3.4. Literatuurstudie: alanine en glycine
Figuur 3.13: Boven: de energieniveaus voor radicaal R1 in alanine bij 77 K
en 293 K met het magneetveld volgens de [001] as. Onder: Het corresponderende EPR spectrum [50].
57
Hoofdstuk 4
Meetopstelling
4.1
Spectrometer
De EPR spectrometer kan opgedeeld worden in 3 deelsystemen: de microgolfbrug, de caviteit en de magneet (zie figuur 4.1).
Er bestaan verschillende soorten spectrometers. Ze kunnen worden ingedeeld naar gelang de frequentie van de gebruikte microgolfstralen. X-, Qen W- band spectrometers werken met een microgolffrequentie tussen respectievelijk 8 en 15 GHz, 30 en 50 GHz en 75 en 100 GHz. In de universiteit
van Gent staat een X- en Q-band spectrometer. Voor metingen in W-band
kunnen we beroep doen op een spectrometer in de universiteit van Antwerpen.
In tabel 4.1 staat het frequentiegebied (range), een typische waarde voor de
frequentie van de microgolven en het magnetisch resonantieveld voor een
vrij elektron voor elke band. De waarde voor het resonantieveld voor een
vrij elektron wordt bekomen uit de resonantieconditie met g = ge = 2.0023:
B=
hν
.
gµB
(4.1)
Voor deze thesis is gebruik gemaakt van een Elexsys-II E500 cw-EPR Qband spectrometer van het merk Bruker (zie figuur 4.2, [51]). De spectrometer is verbonden met een computer. De spectrometer en de computer
communiceren via het programma Xepr in Linux.
De EPR spectrometer kan uitgebreid worden om ENDOR metingen uit te
voeren. Dit wordt besproken in sectie 4.1.5.
58
4.1. Spectrometer
Figuur 4.1: De schematische voorstelling van een spectrometer met o.a. de
bron van microgolven (klystron), de caviteit, de elektromagneet en het modulatiesysteem. Tegenwoordig wordt er geen gebruik meer gemaakt van een
pen recorder, maar wordt de output weergegeven door middel van software
op een computerscherm [9].
Tabel 4.1: Enkele frequentiebanden voor elektromagnetische straling met
een typische waarde voor een frequentie in elke band. B0 is de waarde voor
het veld dat voldoet aan de resonantievoorwaarde voor een vrij elektron
gegeven de typische frequentie.
Band
L
S
C
X
K
Q
V
E
W
F
D
Range
1-2 2-4 4-8 8-12 18-26.5 33-50 50-75 60-90 75-110 90-140 111-170
(GHz)
Freq.
1.5 3.2
5
9.5
24
34
65
75
94
111
140
(GHz)
B0 (mT) 53.5 114.2 188.4 339.0 856.4 1213 2676 3088 3870 3961 4996
59
4.1. Spectrometer
Figuur 4.2: De gebruikte Elexsys-II E500 cw-EPR Q-band spectrometer van
Bruker [51].
4.1.1
Microgolfbrug
De microgolfbrug bestaat uit verschillende delen: de bron van microgolven,
de golfgeleiders en de detector.
De microgolven worden voor de Q-band spectrometer Bruker E500 en de
X-band spectrometer Bruker E300 opgewekt door respectievelijk een Gunndiode en een klystron. In de nieuwere Bruker spectrometers wordt gebruik
gemaakt van een Direct Digital Synthesizer (DDS) systeem.
De bron wekt monochromatische microgolven op. De geproduceerde stralenbundel wordt opgesplitst in twee delen. Eén deel wordt via de referentiearm
naar de detector geleid en genereert een biassignaal. Het andere deel wordt
door een attenuator gestuurd om de intensiteit eventueel te verminderen en
wordt naar de circulator geleid.
De microgolfstralen worden via de circulator in een microgolfgeleider naar
de caviteit gebracht. Daar zal er straling gereflecteerd worden. De werking
van de caviteit wordt in sectie 4.1.2 besproken. De circulator is transparant
voor straling in één richting maar dempt straling in de andere richting (zie
figuur 4.3) [9]. Hierdoor kan de productie van microgolfstraling niet worden
beı̈nvloed door gereflecteerde straling. De gereflecteerde straling wordt via
dezelfde geleider terug naar de circulator gebracht en naar de detector geleid.
60
4.1. Spectrometer
Figuur 4.3: Een 4-poorts microgolfcirculator laat straling enkel in 1 richting
door (zie pijltjes). De straling loopt in de eerste plaats van de bron naar de
caviteit om daar gereflecteerd te worden. Vervolgens loopt de gereflecteerde
straling van de caviteit naar de detector. De terminating load absorbeert
de nog eventueel gereflecteerde straling van de detector [9].
De microgolfgeleiders zouden de straling zo perfect mogelijk moeten geleiden
zodat het gegenereerde signaal niet wordt verstoord.
De detector meet de gereflecteerde straling door middel van een diode. Als
er straling op de diode invalt, creert de diode een stroom die lineair varieert
met de intensiteit van de invallende straling. Als de intensiteit van de gereflecteerde straling afkomstig uit de caviteit verandert, zal dit aanleiding
geven tot een verandering in de diodestroom en resulteren in een EPR signaal.
De diodestroom is slechts in een bepaald gebied lineair afhankelijk van de
invallende straling. Het deel dat werd opgesplitst aan de bron en als biassignaal in de referentiearm werd geleid, wordt terug samengebracht in fase met
de straling afkomstig van de caviteit. Het biassignaal uit de referentiearm
zorgt ervoor dat de detector in het lineair gebied werkt.
4.1.2
Caviteit
De caviteit is het belangrijkste onderdeel van de spectrometer. Hierin wordt
het te onderzoeken sample geplaatst. Het gebruikte caviteitsysteem voor de
Q-band spectrometer is van het type ER 5106 QTE van Bruker (zie figuur
4.4) [51]-[53].
61
4.1. Spectrometer
Figuur 4.4: Het caviteitsysteem met de verschillende regelschroeven en
aansluitingen. De eigenlijke caviteit is aangegeven door de rode ovaal links
onderaan [52, 53].
Voor de Q-band spectrometer is de resonantiecaviteit cilindervormig en de
afmetingen worden zo gekozen dat er zich een staande golfpatroon in kan
ontwikkelen. Via een regelschroef (zie figuur 4.4) kan men een piston in de
caviteit op en neer bewegen om zo de lengte van de caviteit, en bijgevolg de
condities voor een staande golfpatroon, te wijzigen.
De frequentie waarbij een halve golflengte juist overeenkomt met de lengte
van de caviteit, wordt de fundamentele resonantiefrequentie genoemd. Afhankelijk van de lengte kunnen er zich meerdere types, of modes, van
staande golven in de caviteit ontwikkelen. Om een staande golfpatroon
te kunnen ontwikkelen, dient de lengte van de caviteit 12 λ, 1λ, 32 λ,... te
bedragen, met λ de golflengte van de straling.
Het gebruikte staande golfpatroon is T E012 [52, 53]. TE staat voor Transversaal Elektrisch en de subscripten geven de specifieke mode weer (zie figuur
4.5). Voor een typische Q-band frequentie van 34 GHz is de typische
golflengte 8.8 mm.
Doordat er zich staande golven ontwikkelen, wordt er elektromagnetische
energie opgeslagen in de caviteit. Staande golven hebben knopen en buiken.
Door het sample in een maximum, of een buik (zie figuur 4.5), van het
magnetisch veld te plaatsen, zal de absorptie van de straling door het sample
het meest efficiënt gebeuren.
62
4.1. Spectrometer
Figuur 4.5: Het gebruikte staande golfpatroon is T E012 , waarbij de breedte
van de caviteit gelijk is aan λ2 (y-richting) en de hoogte λ (z-richting). Het
sample wordt in een buik van het magnetisch veld geplaatst [53].
Als bij een bepaalde waarde van het magneetveld absorptie kan optreden,
zal er minder straling gereflecteerd worden en bijgevolg minder straling de
detector bereiken. Deze verandering in geabsorbeerde straling, en bijgevolg
gereflecteerde straling, geeft aanleiding tot een EPR signaal.
De Q factor is een maat voor de efficiëntie van de energieopslag in de caviteit
en kan als volgt gedefinieerd worden:
2π(maximale energie die in de caviteit kan worden opgeslagen)
.
gedissipeerde energie per cyclus
(4.2)
Men kan de opgeslagen energie in de caviteit uitzetten in functie van de
microgolffrequentie. Als νr de resonantiefrequentie van de caviteit is waarbij de opgeslagen energie maximaal is, en ∆ν is de volledige breedte op
halve hoogte van de resonantiepiek, kan men de kwaliteitsfactor op een
alternatieve manier definiëren:
Q=
Q=
νr
.
∆ν
(4.3)
Uit formules 4.2 en 4.3 zien we dat de kwaliteitsfactor afneemt bij lagere
resonantiefrequentie en door energieverlies door bv. elektrische stromen in
het sample of in de wanden van de caviteit. Dit laatste kan vermeden
worden door de wanden met zilver te bedekken.
Hoe hoger de frequentie, hoe hoger de resolutie maar hoe kleiner de golfleng63
4.1. Spectrometer
te, hoe kleiner de resonantiecaviteit, hoe minder materiaal er in de caviteit
kan gebracht worden en bijgevolg hoe minder staling er kan geabsorbeerd
worden. Hierdoor is het signaal zwakker en ontstaat er een afweging tussen
hogere frequenties en grotere caviteiten. Praktisch neemt de grootte van de
caviteiten af en de resolutie toe naarmate we van L-band over Q-band naar
D-band spectrometers gaan (zie tabel 4.1).
Een hogere frequentie brengt een tweede probleem met zich mee. Uit de
EPR resonantieconditie (vgl. 4.1) volgt dat voor hogere frequenties, hogere
waarden voor het magneetveld nodig zijn. Commerciële elektromagneten
halen een maximum magnetisch veld van ongeveer 3 T en in de universiteit van Nijmegen staat momenteel een supergeleidende magneet die een
constant magnetisch veld van maximaal 33 T kan onderhouden. Deze maximale waarde voor het magneetveld creëert een limiet voor de gebruikte
microgolffrequentie.
De straling in de microgolfgeleider gaat via de iris de caviteit binnen. De iris
zorgt dus voor de koppeling van de straling tussen de microgolfgeleider en de
caviteit. Via een schroef (zie figuur 4.4) kan men de irisopening aanpassen en
bijgevolg de koppeling tussen de golfgeleider en de caviteit veranderen. Men
spreekt van kritische koppeling wanneer alle microgolfenergie gekoppeld is in
de caviteit. Hierbij wordt er geen straling gereflecteerd naar de detector. De
straling die de detector dan bereikt, is enkel afkomstig van de referentiearm.
Bijgevolg zou de diodestroom niet mogen veranderen als er meer of minder
wordt geattenueerd.
Uit de bespreking hierboven volgt dat de frequentie van de microgolven
voor een groot deel de eigenschappen, en vooral de dimensie, van de caviteit
bepalen. Hierdoor is het aangewezen om de frequentie van de microgolven
constant te houden zodat we niet steeds opnieuw hoeven te calibreren. Dit
is de reden waarom we bij metingen eenvoudigweg het magnetisch veld
variëren en niet de frequentie.
Om de caviteit te koelen, kan ze ondergedompeld worden in koude gassen.
Een dewarvat kan worden aangesloten op de cryostaat door middel van
een hevel. Men kan vloeibare stikstof gebruiken om te koelen tot 77 K of
vloeibare helium om tot 4 K te gaan. De ruimte rond de caviteit wordt
vacuüm gezogen door middel van een rotatiepomp en een turbomoleculaire
pomp om thermisch te isoleren.
Er zijn verschillende aansluitingen op het caviteitsysteem voorzien om o.a.
een thermokoppel of een coaxkabel voor de rf golven om ENDOR metingen
64
4.1. Spectrometer
(zie sectie 4.1.5) te kunnen uitvoeren.
4.1.3
Magneet
Het magneetveld wordt opgewekt door een elektromagneet. Deze bestaat
hoofdzakelijk uit 2 watergekoelde spoelen en een stroombron. Aan een van
de poolschoenen is een Hall-probe bevestigd. Een Hall-probe meet het magnetisch veld en produceert een spanning evenredig met het gemeten veld.
De gemeten waarde uit de probe wordt als feedback gebruikt om eventuele
afwijkingen van het gewenste magneetveld te corrigeren. Het is belangrijk
dat het magneetveld uniform over het hele sample is en stabiel blijft. De
grote stabiliteit wordt bekomen door een precies regelbare stroombron te
gebruiken.
Er wordt een scansysteem gekoppeld aan de stroombron waardoor we het
magneetveld lineair kunnen laten variëren. Indien we een hogere precisie van
de waarde van het magneetveld wensen te bekomen, kan men beroep doen
op een resonantie- (NMR) probe. Deze resonantieprobe is geplaatst nabij
de caviteit en meet een calibratiespecimen met precies gekende g-waarden.
De waarde van het werkelijke magneetveld wordt uit de resonantieconditie
(vgl. 4.1) gehaald. Achteraf kan er genormaliseerd worden naar de correcte
waarde van het magneetveld.
Uit tabel 4.1 volgt dat er magneetvelden van ongeveer 1200 mT nodig zijn
voor metingen in Q-band.
4.1.4
Modulatiesysteem
Er is een groot nadeel aan de hierboven besproken spectrometers. In het
signaal zit een grote ruiscomponent. De lage frequentieruis is o.a. afkomstig van temperatuurfluctuaties, fluctuaties in de detectorstroom, fluctuaties
in de Q-factor, ... Men kan deze lage frequentieruis voorkomen door een
fasegevoelige detectietechniek toe te passen. Hierbij wordt het magneetveld
gemoduleerd met een magneetveld met een frequentie van typisch 100 kHz
en een kleine amplitude. Het modulerend magneetveld wordt opgewekt door
extra kleinere Helmholtzspoelen aan beide kanten van de caviteit.
In figuur 4.6 wordt het principe van fasegevoelige detectie verklaard [9].
Het magneetveld varieert tussen de waarden Ha en Hb . Hierdoor zal het
outputsignaal van de detector oscilleren tussen de waarden ia en ib . Door een
65
4.1. Spectrometer
Figuur 4.6: Het principe van een gemoduleerd magnetisch veld. De amplitude van de modulatie van het outputsignaal is evenredig met de modulatieamplitude van het magneetveld en de eerste afgeleide van het absorptiespectrum [9].
fasegevoelige detector te kiezen die enkel signalen met een frequentie rond
de modulatiefrequentie selecteert, zal enkel de ruis met frequentie rond de
modulatiefrequentie gedetecteerd worden. Alle ruis met een andere, meestal
lagere, frequentie zal weggefilterd worden.
Indien de modulatieamplitude (Hb − Ha ) klein is in vergelijking met de
breedte van het te meten absorptiespectrum, mag men het absorptiespectrum als lineair beschouwen. Als het magneetveld varieert tussen Ha en
Hb , en bijgevolg het output signaal varieert tussen ia en ib , zal het verschil ib − ia evenredig zijn met de helling, of richtingscoëfficiënt, van het
absorptiespectrum en met de modulatieamplitude (Hb − Ha ):
ib − ia ∼ (Hb − Ha ) · richtingscoëf f icient
of
richtingscoëf f icient ∼
ib − ia
.
Hb − Ha
(4.4)
(4.5)
De amplitude van de modulatie van het outputsignaal zal bijgevolg evenredig
zijn met de eerste afgeleide van het absorptiespectrum. Dit is de reden
waarom een EPR spectrum de eerste afgeleide van het absorptiespectrum
weergeeft.
Indien men de modulatieamplitude te groot neemt, wordt een te groot deel
66
4.2. Kristalpreparatie
van het absorptiespectrum doorlopen en zal het outputsignaal vervormen
en verbreden. Ook is het mogelijk dat de opsplitsing tussen 2 dicht bij
elkaar gelegen EPR signalen niet meer wordt gedetecteerd bij een te grote
modulatieamplitude.
Indien men het signaal over een bepaalde tijd, de tijdsconstante, integreert,
kan men de gevoeligheid van de detector nog verhogen. De tijdsconstante
fungeert als een responstijd voor de detector. Door integratie met een
bepaalde tijdsconstante wordt de willekeurige ruis uitgemiddeld. Een nadeel
is dat het signaal ook wordt uitgemiddeld. Indien de tijdsconstante te groot
wordt gekozen, wordt het signaal vervormd of volledig uitgemiddeld. Bij
een te korte tijdsconstante zal niet alle ruis uitgemiddeld zijn.
Ook kan men meerdere scans laten lopen. De intensiteit van het signaal is
lineair afhankelijk met het aantal scans (n). De ruis neemt slechts toe volgens de vierkantswortel van het aantal scans. De signaal-ruis verhouding zal
√
bij toenemend aantal scans slechts toenemen volgens √nn = n. Meerdere
scans nemen is bijgevolg een inefficiënte manier om de gevoeligheid van de
spectrometer te verhogen en zou best als laatste techniek toegepast worden.
4.1.5
Uitbreidingen voor ENDOR metingen
Voor ENDOR metingen laat men radiofrequente (rf) straling op het sample
invallen.
Een signaal met regelbare frequentie in het MHz gebied wordt opgwekt door
een rf-generator en via een coaxkabel naar de caviteit geleid. In de caviteit
zitten ENDOR spoelen die het signaal omzet naar een rf-excitatieveld.
Om de signaal-ruis verhouding te verhogen wordt bij ENDOR, analoog als
bij EPR, een fasegevoelige detectietechniek toegepast door middel van modulatie van het ENDOR signaal. Dit resulteert in de eerste afgeleide in het
ENDOR spectrum.
4.2
4.2.1
Kristalpreparatie
Threonine
Threonine is een essentieel aminozuur. Het is de carboxylgroep in een aminozuur die verantwoordelijk is voor het zuur karakter.
67
4.2. Kristalpreparatie
Figuur 4.7: Structuurformulle van L-threonine.
Threonine kent vier stereo-isomeren: L-threonine, R-threonine, L-allo-threonine en R-allo-threonine. Enkel L-threonine (threo-α-amino-β-hydroxy-nbutyric zuur) is van biologisch belang voor het lichaam..
De structuur van L-threonine is weergegeven in figuur 4.7 en heeft als algemene formule R − CH(N H2 ) − COOH met R = −CH(OH) − CH3 .
Het kristalrooster van L-threonine is orthorombisch: de 3 kristalassen staan
loodrecht op elkaar maar zijn niet even lang. We hebben voor de lengte van
de as a=7.738 Å, b=13.625 Å en c=5.137 Å [54].
Het L-threoninekristal heeft de symmetrieëigenschappen van de ruimtegroep
P 21 21 21 (nummer 19 volgens de nummering van The International Union of
Crystallography (IUCr) [55]), wat betekent dat er drie tweevoudige symmetrieassen te construeren zijn. De moleculen binnen een eenheidscel kunnen
in elkaar worden omgezet door de symmetrieoperaties van de ruimtegroep.
De moleculen in het kristal buiten een eenheidscel kunnen bekomen worden
door translatie van de moleculen binnen de eenheidscel in de richting van
de a-, b- of c-as en met translatieafstand de lengte van de respectievelijke
as.
De kristallen die gebruikt werden voor deze masterproef werden gegroeid
uit wit L-threoninepoeder, geleverd door Sigma-Aldrich, door trage evaporatie uit een gesatureerde oplossing. In een eerste poging kregen we zeer
dunne, onbruikbare schilfers van minder dan een millimeter dik. We hebben
de gesatureerde vloeistof bewaard bij KT en bij een lagere temperatuur
(koelkast). Beide methoden werkten. Bij de vloeistof die we bewaarden in
de koelkast kregen we na ongeveer een maand kristallen, bij de vloeistof op
KT iets sneller.
De bestudeerde kristallen groeiden naaldvormig, preferentieel met de cas in de richting van de lengteas van de naald. De doorsnede van de
naald was ruitvormig, met de a- en b-as volgens de diagonalen. Voor de
oriëntatie volgens de rotatie c-as werd het naaldkristal in een quartzbuisje
68
4.2. Kristalpreparatie
geplaatst. Voor oriëntatie volgens de overige rotatieassen werd het kristal
op een kwartsstaafje gelijmd.
Voor de Q-band EPR caviteit van Bruker zonder ENDOR spoelen mogen de
kwartsstaafjes een maximale diameter van 2 mm hebben. Voor de gebruikte
Q-band ENDOR caviteit is de maximale diameter 1.6 mm [52, 53]. Het
kristal mag dus zeker nergens breder zijn dan 1.6 mm, anders bestaat het
risico dat het kristal de ENDOR spoelen raakt en beschadigt of dat het
kristal loskomt en in de caviteit valt.
4.2.2
Bestraling van het kristal
Om ongepaarde elektronen in het kristal te creëren, wordt het kristal bestraald met X-stralen, opgewekt door een X-stralenbuis (zie figuur 4.8).
Een stroom loopt door een wolfraamfilament. Hierdoor warmt dit filament
op en worden er elektronen thermisch geëmitteerd. Het filament is een deel
van het negatieve kathodesysteem.
De anode bestaat eveneens uit wolfraam en wordt op een hoge positieve
potentiaal gebracht waardoor de thermisch geëmitteerde elektronen worden
versneld. De elektronen bombarderen de anode en worden daar afgeremd,
wat resulteert in een remstralenbundel die gebruikt wordt om het kristal te
bestralen.
De stralingsdosis wordt uitgedrukt in gray en is een maat voor de hoeveelheid geabsorbeerde ioniserende straling, gemeten in J/kg. De sievert wordt
eveneens uitgedrukt in J/kg maar is een maat voor de equivalente dosis,
die het biologisch effect van de straling (α-, β-, γ-,... straling) in rekening
brengt. Bij een dosis van 6 tot 10 Gy bedraagt de mortaliteit na 14 dagen
100% [22].
Het gebruikte toestel om threoninekristallen te bestralen is een Philips PW
1370. De stroom was ingesteld op 40 mA en de spanning op 60 kV. De
afstand tussen de X-stralenbuis en de kristallen was ongeveer 3 cm. Dit
geeft een dosis van ongeveer 1.3 kGy per minuut. De kristallen werden 2
keer 30 minuten bestraald bij KT, wat resulteert in een totale dosis van
ongeveer 78 kGy.
69
4.2. Kristalpreparatie
Figuur 4.8: Schematische voorstelling van een X-stralenbuis.
4.2.3
Oriëntatie van het kristal
De kristallen werden georiënteerd met behulp van een X-ray diffraction
(XRD) scanner.
Bij XRD laat men een monochromatische X-stralenbundel invallen op het
kristal. Volgens Bragg vormen de moleculen in het kristal een verzameling
van netvlakken waaraan de invallende straling kan gereflecteerd worden. Er
treedt reflectie op als aan de volgende vergelijking is voldaan [56]:
2dhkl sin θ = nλ,
(4.6)
met (hkl) de millerindices voor het reflecterende vlak, dhkl de afstand tussen
de (hkl) vlakken, θ de hoek tussen het reflectievlak en de invallende straling,
n een natuurlijk getal en λ de golflengte van de invallende straling (zie figuur
4.9).
De hoeken waarvoor er reflectie optreedt, de millerindices van het corresponderende vlak, de intensiteit van de gereflecteerde straling en de golflengte
van de gebruikte invallende straling zijn in een fiche samengevat (voor threonine zie [57]).
Om het kristal te oriënteren, wordt het kristal op een goniometer gelijmd en
in de XRD scanner geplaatst. We oriënteren de bron en de detector onder
een hoek (θ in figuur 4.9, de waarde wordt gehaald uit de fiche) waarvoor we
weten dat er reflectie aan een (hkl)-vlak, bv. het (020)-vlak, loodrecht op de
b-as, kan optreden. Door het kristal in twee richtingen, φ en χ, te draaien,
zal, bij welbepaalde hoekcombinaties, de stralenbundel gereflecteerd worden.
De gereflecteerde stralenbundels kunnen grafisch weergegeven worden door
70
4.2. Kristalpreparatie
Figuur 4.9: X-stralen diffractie volgens Bragg: reflectie aan netvlakken [56].
middel van een poolfiguur. Door identificatie van de gereflecteerde bundels
op de poolfiguur kan men de oriëntatie van het kristal bepalen. In ons voorbeeld zal er o.a. reflectie aan het (020)-vlak optreden en kunnen we de b-as
vinden. De gevonden φ- en χ-waarden van de gereflecteerde bundel worden
ingesteld op de goniometer en men zet het kristal over op een kwartsstaafje.
Dit kwartsstaafje wordt dan in de caviteit van de spectrometer geplaatst.
71
Hoofdstuk 5
Experimentele resultaten
In dit hoofdstuk worden de experimentele resultaten uit deze masterproef
besproken. De simulaties van de spectra zijn gemaakt met EasySpin [58],
een apart pakket in Matlab die gebruik maakt van exacte diagonalisatie van
de spin Hamiltoniaan.
De tensoren werden gefit met het programma Magres [59, 60]. De daarin
gebruikte methode gaat uit van een systeem met S = I = 21 en een isotrope
g-tensor in de benaderende spin Hamiltoniaan
~ˆz · Ā¯ · I~ˆ − gN µN B
~ · I,
~ˆ
Ĥ = gµB B Ŝz + S
(5.1)
waarbij de z-as in de richting van het magneetveld ligt. Bij het programma
wordt de kleinste-kwadraten methode toegepast met parameters voor de
kanteling van de rotatieassen.
5.1
EPR
In figuur 5.1 wordt het EPR spectrum weergegeven van threonine éénkristallen, bestraald bij KT, gemeten bij 20 K en met de a-, b- en c-as volgens
de richting van het magneetveld. De microgolffrequentie werd genormeerd
naar 33.962 GHz.
Uit de EPR spectra blijkt een vrij isotrope g-waarde die niet veel afwijkt
van de vrije elektron g-waarde voor alle bestudeerde radicalen. Hierdoor
overlappen de spectra van de radicalen. De anisotropie van de A-tensoren
(zie verder) ligt aan de basis van de verschillen in de EPR spectra voor de
verschillende oriëntaties.
72
5.1. EPR
Figuur 5.1: De EPR spectra met (a) de kristallografische a-, (b) b- en (c)
c-as volgens de richting van het magneetveld, gemeten bij 20 K na bestraling
bij KT en met een microgolfvermogen van ongeveer 0.01 mW.
73
5.2. ENDOR en EIE
Voor de a-, b- en c-as volgens de richting van het magneetveld kan men
respectievelijk 11, 18 en 23 duidelijke EPR lijnen onderscheiden. Uit een
EPR angulaire variatie kan men geen gedetailleerde beschrijving van het
complexe EPR spectrum, afkomstig van alle radicalen, afleiden. Om een
betere resolutie voor de hyperfijnkoppelingen voor de verschillende radicalen
te bekomen en om het EPR spectrum te ontbinden in zijn samenstellende
componenten, zijn we gestart met ENDOR en ENDOR-induced EPR (EIE)
metingen.
5.2
ENDOR en EIE
In figuur 5.2 staan de ENDOR spectra, gemeten bij 20 K, voor de kristallografische a-, b- en c-as volgens de richting van het magneetveld (posities
aangeduid in figuur 5.1). Sommige lijnen, zoals de lijn bij 99.26 MHz voor
de a-as in de richting van het magneetveld, blijven over een groot gebied van
het magneetveld zichtbaar en intens in de ENDOR spectra terwijl andere
lijnen enkel bij welbepaalde magneetveldwaarden zichtbaar zijn.
Bij hoekafhankelijke ENDOR metingen konden we 8 verschillende interacties in de drie kristallografisch belangrijke vlakken volgen. Deze zijn weergegeven in figuur 5.3. Eerst wordt de rotatie in het ab-vlak, vervolgens in
het bc-vlak en tenslotte in het ac-vlak getoond. De ENDOR frequenties
werden genormeerd naar 1210 mT. Sommige interacties konden moeilijk of
niet in de drie vlakken gevolgd worden. De hyperfijnkoppelingstensoren
voor deze interacties zouden eventueel met grote moeite bepaald kunnen
worden, maar zijn niet nader onderzocht wegens tijdsgebrek.
Om de ENDOR lijnen te associëren met de corresponderende radicalen
hebben we EIE metingen uitgevoerd bij 20 K. Deze leveren minstens 4
verschillende radicalen op (zie figuur 5.4). 4 van de hyperfijninteracties,
HF1(R1) tot HF4(R1), konden we associëren met radicaal R1, 2 hyperfijninteracties, HF1(R2) en HF2(R2), met radicaal R2, 1 lijn, HF1(R3), die
extra site splitted is door een mistilt van de rotatieas, met radicaal R3 en 1
interactie, HF1(R4), met radicaal R4 (zie figuren 5.2 en 5.3).
Om het EIE spectrum van radicalen R1 en R2 volledig te kunnen verklaren
zijn er extra, kleinere interacties nodig. Voor de a-as volgens het magneetveld is er een extra ENDOR lijn gevonden en toegewezen met EIE aan
radicaal R2 (HF3(R2)). Voor de b-as volgens het magneetveld zijn er 2 extra
lijnen (HF5(R1) en HF6(R1)) toegewezen aan radicaal R1 en 1 (HF3(R2))
74
5.2. ENDOR en EIE
Figuur 5.2: De ENDOR spectra bekomen voor de magneetveldposities
aangeduid in figuur 5.1 bij 20 K.
75
5.2. ENDOR en EIE
Figuur 5.3: De ENDOR resonanties van de verschillende radicalen in de drie
rotatievlakken.
aan radicaal R2 (zie figuur 5.2). De ENDOR lijnen van deze kleinere interacties (ongeveer 10 MHz) bevinden zich in een dichtbevolkt gebied die
bovendien, door de anisotropie van de interacties, voor sommige oriëntaties
van het kristal wellicht dicht bij de vrije proton frequentie liggen. Mits zeer
grote moeite zouden de ENDOR lijnen misschien in de drie rotatievlakken gevolgd, en de koppelingstensoren bepaald kunnen worden maar dit is,
wegens tijdsgebrek, niet kunnen gebeuren.
In figuur 5.4 is de ontbinding van het EPR spectrum in de deelcomponenten
weergegeven door middel van de EIE spectra van de verschillende radicalen.
Radicaal R1 is het meest dominante radicaal. Voor de a- en b-as volgens
het magneetveld verklaart radicaal R1 bijna alle intense lijnen in het EPR
spectrum. Voor de b-as volgens het magneetveld wordt een lijn verklaard
door radicaal R2 (zie figuur 5.4). Radicaal R2 levert globaal gezien slechts
een kleine bijdrage. Radicalen R3 en R4 zijn minder intens (bemerk het
hoge ruisniveau) waardoor ze niet of nauwelijks zichtbaar zijn in de EPR
spectra.
76
5.2. ENDOR en EIE
Figuur 5.4: De EIE en EPR spectra van de 4 radicalen. Voor de a- en
b-as volgens de richting van het magneetveld werd de microgolffrequentie
genormeerd naar respectievelijk 33.924 GHz en 33.925 GHz.
77
5.2. ENDOR en EIE
5.2.1
Het EIE spectrum voor de a-as volgens het magneetveld
Uit figuur 5.2 kunnen we de opsplitsing voor de verschillende radicalen
berekenen (zie sectie 1.2.5.2). Voor de a-as volgens het magneetveld heeft
radicaal R1 een grote hyperfijninteractie van ongeveer 115 MHz, 2 ongeveer
even grote hyperfijninteraties in de buurt van 70 MHz en een kleinere hyperfijninteractie van 30 MHz. In het EIE spectrum resulteert dit in 6 doubletten met relatieve intensiteit 1:1:2:2:1:1:1:1:2:2:1:1 waarbij de absorptiepieken
van de middelste lijnen overlappen. De simulatie en het EIE spectrum zijn
gegeven in figuur 5.5 (a).
Voor radicaal R2 ziet men 2 ongeveer even grote hyperfijninteracties en
een kleinere interactie van bij benadering 10 MHz. Het EIE spectrum voor
radicaal R2 wordt gekarakteriseerd door een triplet met een opsplitsing van
ongeveer 100 MHz. De simulatie en het EIE spectrum zijn weergegeven in
figuur 5.6 (a).
Radicaal R3 heeft een hyperfijnkoppeling van rond de 34 MHz. In het EIE
spectrum ziet men een doublet (zie figuur 5.4). Waarschijlijk is er nog een
grotere interactie die niet gevolgd kon worden maar die de grote opsplitsing
in het doublet kan verklaren.
Radicaal R4 heeft een hyperfijnkoppeling van ongeveer 25 MHz. Het EIE
spectrum toont een breed singlet.
5.2.2
Het EIE spectrum voor de b-as volgens het magneetveld
Met de b-as volgens het magneetveld heeft radicaal R1 een grote hyperfijninteractie in de buurt van 115 MHz, 2 ongeveer even grote hyperfijnkoppelingen van rond de 75 MHz, een koppeling van ongeveer 50 MHz en twee
kleinere van bij benadering 14 MHz (zie figuur 5.2). In het gecompliceerde
EIE spectrum overlappen de middelste pieken. De simulatie en het EIE
spectrum zijn weergegeven in figuur 5.5 (b).
Radicaal R2 heeft 2 ongeveer even grote koppelingen en een kleinere interactie van respectievelijk ongeveer 100 MHz en 10 MHz. Het EIE spectrum
toont ook voor deze oriëntatie een triplet. De simulatie en het EIE spectrum
zijn weergegeven in figuur 5.6 (b).
Radicaal R3 heeft een grote koppeling van rond de 75 MHz en een kleine in
de buurt van 10 MHz Men ziet een doublet in het EIE spectrum (zie figuur
5.4). Voor radicaal R4 zien we 2 ongeveer even grote koppelingen van rond
78
5.2. ENDOR en EIE
de 30 MHz. In het EIE spectrum (zie figuur 5.4) ziet men een doublet.
Waarschijnlijk is er nog een grotere interactie die niet gevolgd kon worden.
5.2.3
Het EIE spectrum voor de c-as volgens het magneetveld
Voor de c-as volgens het magneetveld zijn er geen EIE metingen uitgevoerd.
Uit de ENDOR angulaire variatie (zie figuur 5.3) kan men de lijnen uit
het ENDOR spectrum (zie figuur 5.2) toewijzen aan de corresponderende
radicalen. Voor radicaal R1 zien we een grote interactie van ongeveer 125
MHz, 2 ongeveer even grote koppelingen van 70 MHz en een kleinere van
rond de 30 MHz. Radicaal R2 heeft 2 bij benadering even grote koppelingen
in de buurt van 100 MHz. Radicalen R3 en R4 hebben een koppeling van
respectievelijk ongeveer 50 MHz en 25 MHz.
5.2.4
Opmerkingen
Uit de plaats van de EIE spectra van radicalen R3 en R4 kan men afleiden
dat de g-waarden voor de verschillende oriëntaties vrij anisotroop zijn en
redelijk veel afwijken van de vrije elektron g-waarde. Aangezien deze minder
intens zijn, is dit niet zichtbaar in de EPR spectra. Een verklaring voor deze
anisotropie wordt gegeven in sectie 5.5.
In alle EIE spectra hebben de middelste absorptiepieken schijnbaar een
lagere intensiteit dan de buitenste terwijl dit in de simulaties niet het geval
is. Men kan vermoeden dat dit te wijten is aan de spectrometer zelf.
In figuren 5.7 en 5.8 worden de 2 dimensionele FF-ENDOR (Field-Frequency-ENDOR) spectra getoond voor respectievelijk de a- en b-as volgens het
magneetveld. Deze spectra tonen de intensiteit van de verschillende ENDOR lijnen in functie van het statisch magneetveeld. Bij een horizontale
snede wordt het ENDOR spectrum weergegeven, bij een verticale het EIE
spectrum.
De hyperfijninteracties horende bij de verschillende radicalen zijn aangegeven in de figuren. Voor bepaalde interacties van radicalen die niet in de drie
rotatievlakken gevolgd worden (vb. bij de ENDOR frequenties in de buurt
van 97 MHz en 120 MHz), zijn de spectra van de radicalen zichtbaar in de
2D FF-ENDOR metingen.
79
5.2. ENDOR en EIE
Figuur 5.5: De simulatie van radicaal R1 met (a) de a-as en (b) de b-as
volgens het magneetveld.
80
5.2. ENDOR en EIE
Figuur 5.6: De simulatie van radicaal R2 met (a) de a-as en (b) de b-as
volgens het magneetveld.
81
Figuur 5.7: Het 2D FF-ENDOR spectrum voor de a-as volgens het magneetveld.
5.2. ENDOR en EIE
82
Figuur 5.8: Het 2D FF-ENDOR spectrum voor de b-as volgens het magneetveld.
5.2. ENDOR en EIE
83
5.3. Hyperfijninteractietensoren voor radicaal R1
5.3
Hyperfijninteractietensoren voor radicaal R1
Bij EMR metingen proberen we het kristal te roteren volgens de kristallografische assen. Met behulp van XRD metingen kunnen we het kristal vrij
accuraat oriënteren, maar soms kan er, o.a. door transfer van het kristal
op een quartzstaaf, verlies van oriëntatie optreden. Voor sommige metingen
werd het naaldkristal rechtop in een buisje geplaatst waardoor het kristal
mogelijks gekanteld wordt. Dit probleem van misoriëntatie kan opgevangen
worden met behulp van parameters tijdens het fitten.
De oriëntatie van de rotatieassen kan men aangeven met de hoek θ tussen
de rotatieas en de kristallografische c-as en de hoek φ tussen de kristallografische a-as en de projectie van de rotatieas op het ab-vlak.
Voor de bespreking over site splitting verwijzen we naar sectie 2.2.2. Voor
de rotatie in het ab-vlak (rotatie c-as) treedt er geen extra site splitting
op voor radicalen R1, R2 en R4 (zie figuur 5.3). Men kan het kristal voor
deze rotatieas als perfect georiënteerd beschouwen volgens de kristallografische c-as: θ=0 en φ=0. Voor rotatie in het ac- (rotatie b-as), en bc-vlak
(rotatie a-as) treedt er extra site splitting in 4 op. De waarden voor de
oriëntatiehoeken bekomen uit het fitting programma van de interactietensoren zijn weergegeven in tabel 5.1
Bij het fitten van de interactietensoren van de hyperfijnkoppelingen aan de
hoekafhankelijke ENDOR metingen (zie figuur 5.3) kan men 2 verschillende
sets van hoofdwaarden en richtingscosinussen bekomen. De ene set geeft
de reële fysische hoofdwaarden en richtingscosinussen, de andere set is een
fysisch incorrecte maar wiskundig juiste tensor. De laatste wordt de Schonlandvorm genoemd en men spreekt van Schonland ambiguı̈teit [61, 62].
In tabel 5.3 staan de 2 sets van interactietensoren van de grootste 4 hyperfijnkoppelingen van radicaal R1. Voor een orthorombisch kristal zijn de
verschillende sites gelinkt door de relaties weergegeven in tabel 5.2. De
richtingscoëfficiënten voor de verschillende sites kan men bekomen door het
Tabel 5.1: De waarden voor de kanteling
van de kristallografische assen.
θ (◦ )
Rot c
0
Rot a 90.51
Rot b 90.98
84
van de rotatieassen ten opzichte
φ (◦ )
0
3.05
94.13
5.3. Hyperfijninteractietensoren voor radicaal R1
Tabel 5.2: De symmetrieoperaties tussen de verschillende sites voor een
orthorombisch kristal
Site Coördinaten
1
(x,y,z)
2
(-x,-y,z)
3
(x,-y,-z)
4
(-x,y,-z)
teken van de richtingscoëfficiënten aan te passen volgens de symmetrieoperaties in tabel 5.2.
De twee sets verschillen voor HF1(R1), HF2(R1) en HF4(R1) niet veel (tot
ongeveer 14◦ verschil in richting, zie tabel 5.3). Enkel voor HF3(R1) is er
een verschil tot ongeveer 31◦ en verschilt de anisotrope hyperfijnkoppeling
aanzienlijk. Voor HF3(R1) uit de tweede set werd uit de fitting een aanzienlijke tilting van de rotatieassen afgeleid (tot 10◦ ), wat fysisch niet het geval
was. Ook de vorm van de anisotrope hyperfijnkoppeling strookt niet met
deze van een α-, β- of hydroxyl proton. We concluderen dat, voor HF3(R1),
deze van set 1 de fysisch correcte tensor is.
Het anisotroop deel van hyperfijninteracties HF1(R1)-HF3(R1) is klein en
van de vorm (2b, -b, -b). Dit komt overeen met de vorm voor een β proton.
De vorm van het anisotroop deel voor HF4(R1) geeft aan dat het niet om een
β-proton gaat. De waarde van de anisotrope hyperfijnkoppeling is te klein en
de vorm komt niet overeen met deze verwacht voor een α-proton. Mogelijks
komt deze hyperfijninteractie van een uitwisselbaar hydroxylproton.
Voor de interacties van radicaal R1 werden de tensoren nauwkeurig bepaald
waardoor het mogelijk is om de ENDOR angulaire variatie te simuleren.
Deze worden getoond door de volle lijnen in figuur 5.3.
Voor de interacties van radicalen R2, R3 en R4 wordt een benadering
getoond. Deze benadering fit een functie voor elk rotatievlak afzonderlijk en waarbij de g-waarde isotroop is verondersteld. De functie is van de
vorm (analoog als aan 2.58) [62]:
1
(α + β cos 2θ + γ sin 2θ) 2 ,
met θ de rotatiehoek en α, β en γ parameters die gefit worden.
85
(5.2)
Tabel 5.3: De 2 schonland toegevoegde sets van hyperfijninteractietensoren voor de grootste 4 interacties in radicaal R1.
Set1
Set2
Interactie
Aiso
Aaniso
Richt.cos. t.o.v.
Aiso
Aaniso
Richt.cos. t.o.v.
Verschil (◦ )
a-as b-as c-as
a-as b-as c-as
(MHz)
(MHz)
(MHz)
(MHz)
7.26
0.111 0.268 -0.957
7.44
0.138 0.308 -0.941
4
-2.73
0.877 -0.480 -0.033
-3.08
0.955 -0.294 0.043
12
HF1(R1) 118.57
118.51
-4.54
0.468 0.835 0.288
-4.37
0.263 0.905 0.335
12
9.45
0.593 0.796 0.123
9.23
0.617 0.787 -0.006
7
-4.47
0.431 -0.442 0.786
-3.40
0.588 -0.455 0.669
11
HF2(R1)
70.87
71.12
-4.97
0.680 -0.413 -0.605
-5.83
0.524 -0.416 -0.743
12
8.81
0.229 -0.712 -0.664
8.33
0.018 -0.738 -0.675
12
-4.02
0.969 0.102 0.225
-1.67
0.822 -0.374 0.430
31
HF3(R1)
68.53
68.69
-4.79
0.092 0.695 -0.713
-6.7
0.570 0.562 -0.600
29
17.02
0.193 -0.968 -0.162
17.1
0.177 -0.979 0.099
14
-6.66
0.624 0.248 -0.741
-5.86
0.628 0.035 -0.777
12
HF4(R1)
38.14
37.98
-10.37
0.757 0.042 0.652
-11.23
0.757 0.200 0.622
9
5.3. Hyperfijninteractietensoren voor radicaal R1
86
5.4. Temperatuursafhankelijkheid van de EPR spectra
5.4
Temperatuursafhankelijkheid van de EPR spectra
Bij radicalen in threonine kunnen we verwachten dat de interacties met de
protonen uit de methylgroep gelijkaardig zijn aan deze geobserveerd in alanine [50]. Voor alanine kan deze methylgroep vrij roteren bij KT waardoor
de interacties van de methylprotonen equivalent worden. Bij lage temperatuur kan de groep niet vrij roteren waardoor deze equivalentie verdwijnt,
wat resulteert in een verandering in het EPR spectrum (zie sectie 3.4.2.2).
Om deze verandering in het EPR spectrum eventueel te observeren in threonine zijn we met temperatuursafhankelijke EPR metingen gestart.
In figuur 5.9 wordt het EPR spectrum getoond voor temperaturen van 20
K tot KT. Het EPR spectrum verandert geleidelijk, maar er zijn grote
verschillen te zien bij de overgang van 80 K naar 60 K.
Om te achterhalen welke lijnen er van welke radicalen veranderen, werden
temperatuursafhankelijke EPR metingen voor een oriëntatie dicht bij de aas uitgevoerd. Radicaal R1 is het enige radicaal waar we zeker weten dat
er minstens 3 interacties van β-protonen afkomstig zijn (zie tabel 5.3) en
bovendien is dit radicaal dominant aanwezig in het EPR spectrum. Dit
maakt radicaal R1 interessant om zijn temperatuursafhankelijkheid verder
te onderzoeken.
In figuur 5.10 worden het experimentele EPR spectrum en de gesimuleerde
EIE en EPR spectra van radicaal R1 getoond. Het EPR spectrum bij 20 K
kan met radicaal R1 vrij goed worden gereproduceerd waardoor het mogelijk
is om de experimentele EPR lijnen bij 20 K te identificeren. Vervolgens
proberen we de verandering van deze lijnen in het EPR spectrum bij KT te
analyseren.
In figuur 5.10 wordt de kleinere opsplitsing, goed zichtbaar voor de uiterste
doubletten en aangeduid met pijltjes, waarschijnlijk veroorzaakt door het
hydroxylproton (zie HF4(R1) in tabel 5.3). In dezelfde figuur zien we dat
de grootte van de opsplitsing niet veel verandert met de temperatuur. Dit
steunt de stelling dat het proton niet afkomstig is van de methylgroep, waar
verwacht wordt dat de koppelingen vrij veel veranderen, maar wel van de
hydroxylgroep.
Voor de overige lijnen in het EPR spectrum kan men concluderen dat het
aantal en de posities van de lijnen wel drastisch veranderen. Bijgevolg kunnen deze lijnen afkomstig zijn van de protonen uit de methylgroep en is
87
5.5. Bespreking van de resultaten en conclusies
Figuur 5.9: Het EPR spectrum van threonine, bestraald bij KT en gemeten
bij temperaturen gaande van 20 K tot KT.
dit een aanwijzing voor de eventueel gehinderde rotatie van de groep bij
lage temperatuur. Merk op dat het tegen de verwaching in is dat het EPR
spectrum bij hoge temperatuur complexer is dan bij lage temperatuur.
Voor een volledige beschrijving van de spectra zijn er bijkomende metingen
nodig voor andere oriëntaties van het threoninekristal, waar de veranderingen van de posities van de lijnen duidelijker zijn. Dit is wegens tijdsgebrek
niet verder onderzocht.
5.5
Bespreking van de resultaten en conclusies
In tabel 5.3 zien we dat het ongepaarde elektron in radicaal R1 interageert
met minstens 3 β-protonen en een proton uit een hydroxyl (-OH) groep.
Voor de interactie met minstens 3 β-protonen zien we in figuur 5.11 dat
het ongepaarde elektron slechts 2 mogelijke plaatsen heeft: C2, waar de
β-protonen afkomstig kunnen zijn van de aminegroep of proton H5, en
C3, waar ze van de methylgroep met koolstofatoom C4 komen of proton
H4. Aangezien uit tabel 5.3 volgt dat de 3 β-protonen niet equivalent zijn,
88
5.5. Bespreking van de resultaten en conclusies
Figuur 5.10: Het EPR spectrum in de buurt van de a-as bij KT en 20 K
samen met de simulaties van de EIE en EPR spectra afkomstig van radicaal
R1.
Figuur 5.11: Structuur van een threoninemolecule.
89
5.5. Bespreking van de resultaten en conclusies
Figuur 5.12: Het radicaalmodel voorgesteld door Sagstuen et al. in alanine
bestraald bij KT en gemeten bij 220 K en 290 K [24, 44].
kan men aannemen dat de betreffende amine- of methylgroep niet vrij kan
roteren.
Beide modellen sluiten nauw aan bij de structuur van een alanineradicaal
voorgesteld door Sagstuen et al. [44] (zie figuur 5.12), waar men eveneens
een interactie met o.a. 3 β-protonen van een methylgroep en een stikstofkern heeft geobserveerd. De interactie met de 14 N-kern resulteerde in een
bijkomende opsplitsing in 3 in de EPR en EIE spectra (analoog als in sectie
1.2.4).
Indien het ongepaarde elektron zich op het koolstofatoom C2 zou bevinden,
zou men, volgens verschillende studies [29, 36, 44] een interactie met de stikstofkern N1 (zie figuur 5.11) moeten zien. Aangezien we het EIE spectrum
van radicaal R1 kunnen simuleren enkel met 3 β-protonen en een proton
uit een hydroxylgroep, dus zonder een interactie met een N-kern, kunnen
we concluderen dat het ongepaarde elektron zich niet op het koolstofatoom
C2 kan bevinden en blijft er slechts 1 mogelijkheid voor de plaats van het
ongepaarde elektron over, nl. het koolstofatoom C3.
Bovendien geeft de interactie van het ongepaarde elektron met een uitwisselbaar proton extra informatie. In figuur 5.11 zien we inderdaad een hydroxyl
groep gebonden aan het koolstofatoom C3, met als interagerend hydroxylproton H6. Dit versterkt de conclusie voor het voorgestelde radicaalmodel,
weergegeven in figuur 5.13 (a).
Het voorstel van de interactie met de protonen uit de methylgroep wordt
ondersteund door het feit dat het EPR spectrum drastisch verandert met
de temperatuur (zie figuren 5.9 en 5.10 en sectie 5.4). Dit kan het gevolg
zijn van de methylgroep met koolstofatoom C4 (zie figuur 5.11) die bij lage
temperatuur niet langer vrij kan roteren [50].
Voor sommige oriëntaties werden extra kleinere interacties geobserveerd.
In figuren 5.11 en 5.13 (a) zien we, naast het hydroxylproton, in totaal 4
β-protonen (H4, H7-H9 in figuur 5.11), wat naast de drie bestudeerde koppelingen een eerste extra interactie kan geven. Ook kunnen de γ-protonen
90
5.6. Suggesties voor verder onderzoek
Figuur 5.13: Verschillende radicaalmodellen voor radicaal R1 in threonine.
op de aminegroep extra koppelingen geven.
Als vormingsmechanisme van het voorgestelde radicaalmodel kan men starten van het oxidatieproduct van threonine: H3 C −CH(OH)−CH(N H3+ )−
ĊOO (zie sectie 3.2.3), wat na deprotonisatie van het H5-proton op het C3atoom (zie figuur 5.11), wat geobserveerd is in alanine [44], resulteert in het
voorgestelde radicaal (zie figuur 5.13 (a)).
Mogelijks is de carboxylgroep geprotoniseerd (zie figuur 5.13 (b)), zoals
geobserveerd door Sanderud in glycine [30] of gesuggereerd door Iwasaki
en Muto [33], en/of de aminegroep gedeprotoniseerd (zie figuur 5.13 (c,d)),
zoals geobserveerd in glycine bij 4.2 K door Nunome et al. [39]. Dit geeft
meerdere gelijkaardige radicaalmodellen, getoond in figuur 5.13 (a-d). In
de literatuur zijn er voor andere materialen gelijkaardige radicaalmodellen
opgesteld, o.a. [24, 44].
Voor radicalen R3 en R4 werd er een vrij grote anisotropie van de gwaarde geobserveerd (zie figuur 5.4). Een een verschil van 30 mT in het
EIE spectrum levert een verschil van rond de 0.0025 in g-waarde. In de
literatuur zijn er voor radicalen in o.a. sucrose met radicaalfragmenten
Ċ(R1 ) − C(R2) = O, met R1 en R2 restgroepen, vrij anisotrope g-waarden
van deze grootte orde geobserveerd en gesimuleerd met DFT berekeningen
[7, 14, 63]. Bij deze fragmenten bevindt een aanzienlijk deel (ongeveer 20
%) van de spindichtheid van het ongepaarde elektron zich op het naburig
O-atoom van de carbonylgroep (C = O).
5.6
Suggesties voor verder onderzoek
Het onderzoek naar stralingsgeı̈nduceerde radicalen in threonine met behulp
van EMR metingen is nog vrij beperkt. Hieronder volgen een paar suggesties
91
5.6. Suggesties voor verder onderzoek
voor verdere studies met betrekking tot threonine.
De verschillende radicaalmodellen in sectie 5.5 zouden kunnen nagegaan
worden met DFT berekeningen. Dit zou uitsluitsel geven over welk model
correct is.
Voor radicaal R2 zouden de interactietensoren bepaald kunnen worden. Op
basis van deze resultaten zouden radicaalmodellen opgesteld en eveneens
afgetoetst kunnen worden via DFT berekeningen.
Voor radicalen R3 en R4 werden niet alle interacties, die nodig zijn om
het EIE spectrum te reconstrueren, in de drie rotatievlakken gevolgd. Een
meer nauwkeurige studie van deze interacties zou mogelijks resulteren in
de interactietensoren. Op basis van de hyperfijnkoppelingen zouden ook
voor deze radicalen, rekening houdend met de vrij grote anisotropie van
de g-waarde, radicaalmodellen kunnen worden opgesteld en gecontroleerd
worden met DFT berekeningen.
Verscheidene kleinere interacties (o.a. HF5(R1), HF6(R1), HF3(R2),...)
werden niet in de drie rotatievlakken gevolgd. Een uitgebreidere studie
is nodig om voor deze interacties een tensor te bepalen.
Het EPR spectrum bij KT verschilt veel van dat bij lage temperatuur. De
radicalen kunnen bij KT bestudeerd worden waarbij men ook interactietensoren kan bepalen. Dit zou eventueel toelaten om radicaalmodellen op te
stellen die het mogelijk maken om de volledige temperatuursafhankelijkheid
te verklaren.
Volgens figuur 5.9 ziet men een duidelijke verandering bij overgang van 80
K naar 60 K. Een uitgebreidere studie zou kunnen bepalen welke radicalen
er eventueel verdwijnen of gevormd worden bij deze temperaturen, wat informatie kan geven welke reactiemechanismen van toepassing zijn.
Vervolgens zou men uit de resultaten van de metingen bij verschillende
temperatuur (20K, 80K, 160K, KT,...) een suggestie voor de reactiemechanismen kunnen opstellen voor stralingsgeı̈nduceerde radicalen in threonine,
wat bijdraagt tot een beter begrip voor de interactie van straling met aminozuren en eventueel proteı̈nen.
92
Bibliografie
[1] B. H. Bransden en C. J. Joachain. Quantum mechanics. Pearson Education Asia Pte Ltd. 2000.
[2] W. Gerlach en O. Stern. Das magnetische Moment des Silberatoms. Z.
Phys., 9:353-355. 1922.
[3] B. Povh, K. Rith, C. Scholz en F. Zetsche. Particles and Nuclei.
Springer-Verlag Berlin Heidelberg. 2008.
[4] J. Ryckebusch. Statistische fysica. Cursus gedoceerd aan 3e bach. fysica
en sterrenkunde. Ugent. academiejaar 2008-2009.
[5] M. Alonso en E. Finn. Fundamentele natuurkunde. 2 elektromagnetisme. Delta Press BV, Overberg. 1994
[6] N. Atherton. Electron spin resonance. Theory and Applications. Ellis
Horwood Limited. 1973.
[7] H. De Cooman. A combined EMR and DFT study of radiation-induced
defects in sucrose and glucose 1-phosphate. PhD thesis, Vakgroep
Vastestofwetenschappen en Centrum voor Moleculaire Modellering,
Universiteit Gent. 2009.
[8] G. Feher. Observation of nuclear magnetic Resonances via the electron
spin resonance line. Phys. Rev., 103:834. 1956.
[9] J. Wertz en R. Bolton Electron spin resonance. Elementary theory and
practical applications. McGraw-Hill book company. 1972.
[10] J. Weil, J. Bolton en J. Wertz. Electron paramagnetic resonance. Elementary Theory and Practical Applications. John Wiley & Sons, Inc.
1994.
93
Bibliografie
[11] E. Fermi. Über die magnetischen Momente der Atomkerne. Z. Physik,
60:320. 1930.
[12] C. Heller en H. McConnell. Radiation damage in organic crystals. 2.
Electron spin resonance of (CO2 H)CH2 CH(CO2 H) in beta-succinic
acid. Mol. Phys., 32:1535-1539, 1960.
[13] P. Erling en W. Nelson. Dependence of α-Proton Hyperfine Couplings
on Free Radical Geometry. J. Phys. Chem. A, 108:7591-7595, 2004
[14] H. De Cooman, E. Pauwels, H. Vrielinck, A. Dimitrova, N. Yordanov,
E. Sagstuen, M. Waroquier en F. Callens. Radiation-induced defects
in sucrose single crystals, revisited: A Combined electron magnetic
resonance and density functional theory study. Spectrochim. Acta, Part
A, 69:1372-1383, 2008.
[15] W.Derbyshire. The coupling between an unpaired electron spin and a
proton two bonds away. Mol. Phys., 32:129-138, 1959.
[16] E. Budzinski en H. Box. Alkoxy radicals: delta proton hyperfine couplings. J. Chem. Phys., 73:2052-2056, 1980.
[17] M. A. Tarpan, H. Vrielinck, H. De Cooman en F. Callens. Determination of the g tensors for the dominant stable radicals in X-irradiated
β-D-fructose single crystals. J. Phys; Chem. A, 113:7994-8000, 2009.
[18] W. H. Brown en T. Poon. Introduction to organic chemistry. Willey
International Edition. 2005.
[19] Institute of chemistry.
http://www.chemie.fu-berlin.de/chemistry/bio/amino-acids en.html
FU Berlin. Laatste update 23 augustus 1994.
[20] R. C. Schuit. Medische biochemie, Moleculaire benadering van de geneeskunde. Bohn Stafleu Van Loghum, Houten. 2000.
[21] National genome research institute.
http://www.genome.gov/Glossary/ Laatste update: 11 april 2011.
[22] K. Bacher. Medical physics. Keuzevak gedoceerd aan de master fysica
en sterrenkunde, Ugent. academiejaar 2009-2010.
[23] H. C. Box. Radiation effects: ESR and ENDOR analysis. Academic
press Inc. New York. 1977.
94
Bibliografie
[24] E. Sagstuen, A. Sanderud en E. O. Hole. Review. The solid-state radiation chemistry of simple amino acids, revisited. Radiation research
162:112-119. 2004.
[25] Y. Karakirovaa, N.D. Yordanova, H. De Cooman, H. Vrielinck en F.
Callens. Dosimetric characteristics of different types of saccharides: An
EPR and UV spectrometric study. Radiation Physics and Chemistry
79:654-659. 2010.
[26] T. Bultreys. EPR-studie van stralingsdefecten in biomoleculen. Bachelorproject, Vakgroep Vastestofwetenschappen, Universiteit Gent. 2010.
[27] I. Miyagawa en K. Itoh. Electron Spin Resonance of irradiated single
crystals of alanine: Hindered rotation of the methyl group in a free
radical. J. CHem. Phys. 36:2157-2163. 1962.
[28] I. Miyagawa en W. Gordy. Electron Spin Resonance of an irradiated
single crystal of alanine: second-order effects in free radical resonances.
J. Chem. Phys. 32:255-263. 1960.
[29] J. R. Morton. Electron spin resonance in irradiated glycine crystals. J.
Am. Chem. Soc. 86:2325-2329. 1964.
[30] A. Sanderud en E. Sagstuen. EPR and ENDOR studies of single crystals of α-glycine X-ray irradiated at 295 K. J. Phys. Chem. B 102:93539361. 1998.
[31] M. Brustolon, V. Chis, A. L. Maniero en L-C. Brunel. New radical
detected by HF-EPR, ENDOR and pulsed EPR in a room temperature
irradiated single crystal of glycine. J. Phys. Chem. A 101:4887-4892.
1997.
[32] F. Ban, J. W. Gauld en R. B. Boyd. A density functional theory study
of the radiation products of glycine. J. Phys. Chem. A 104:5080-5086.
2000.
[33] M. Iwasaki en H. Muto. ENDOR studies of the superhyperfine couplings of hydrogen-bonded protons. IV. Carboxyl radical anions in irradiated glycine and α-amino isobutyric acid. J. Chem. Phys. 61:5315-5320.
1974.
[34] P. B. Ayscough en A. K. Roy. Electron spin resonance studies of fundamental processes in radiation and photo-chemistry. Part 5. Dissociative
95
Bibliografie
electron capture in amino acids at low temperatures. Trans. Faraday
Soc. 64:582-595. 1968
[35] Y. A. Kruglyak. M. K. Pulatova, E. V. Mozdor, E. N. Subina, V. G.
Pasoyan en L. P. Kayushin. Study of the electron structure of radicals
of γ-irradiated glycine and tyrosine and their photo-induced reactions.
Biophysics. 13:480-494. 1971.
[36] M. A. Collins en D. H. Whiffen. The electron spin resonance of irradiated glycine at 77 K. Mol. Phys. 10:317-325. 1966.
[37] V. V. Teslenko, Y. S. Gromovoi en V. G. Krivenko. ENDOR study
of CH2 COOH radicals in γ-irradiated single crystal of glycine. Mol.
Phys. 30:425-435. 1975.
[38] E. Pauwels, T. Verstraelen, H. De Cooman, V. Van Speybroeck en
M. Waroquier. Temperature Study of a Glycine Radical in the Solid
State Adopting a DFT Periodic Approach: Vibrational Analysis and
Comparison with EPR Experiments. J. Phys. Chem. B 112:7618–7630.
2008.
[39] K. Nunome, H. Muto, K. Toriyama en M. Iwasaki. ESR study of oxidation product in irradiated α-amino acids: Nitrogen centered π-radicals
in α-glycine. J. Chem. Phys. 65:3805-3807. 1976.
[40] J. W. Sinclair. ESR study of irradiated glycine at low temperatures. J.
Chem. Phys. 55:245-251. 1971.
[41] V. M. Syutkin en V. A. Tolkatchev. On the limiting stage in H-atom
abstaction by CH2 CO− radicals from matrix molecules in α-glycine
single crystals. Chem. Phys. Lett. 122:201-204. 1985.
[42] D. A. Armstrong, A. Rauk en D. Yu. Solution thermochemistry of
radicals of glycine. J. Chem. Soc. Perkin Trans. 2:553-560. 1995.
[43] E. Pauwels, H. De Cooman, M. Waroquier, E. O. Hole en E. Sagstuen.
On the identity of the radiation-induced stable alanine radical. Phys.
Chem. Chem. Phys. 12:8733-8736. 2010.
[44] E. Sagstuen, E. O. Hole, S. R. Haugedal en W. H. Nelson. Alanine
radicals: Structure determination by EPR and ENDOR of single crystal
X-irradiated at 295 K. J. Phys. Chem. A 101:9763-9772. 1997.
96
Bibliografie
[45] E. Sagstuen, E. O. Hole, S. R. Haugedal, A. Lund, O. I. Eid en R.
Erickson. EPR and ENDOR analysis of X-irradiated L-alanine and
N aHC2 O4 · H2 O. Simulation of microwave power dependence of satellite lines. Nukleonica 42:353-372. 1997.
[46] J. W. Sinclair en M. W. Hanna. ESR study of L-alanine113 C irradiated
at low temperatures. J. Chem. Phys. 50:2125-2129. 1969.
[47] M. Iwasaki, S. Noda en K. Toriyama. ESR spectra of an irradiated
single crystal of difluoromalonamide and hyperfine tensors of α-fluorine
radicals. Mol. Phys. 18:201-212. 1970.
[48] E. A. Friday en I. Miyagawa. Search for a trapped hole in an irradiated
crystal of L-alanine by the ESR technique. J. Chem. Phys. 55:35893594. 1971.
[49] A. Minegishi. Studies of cationic radicals in γ-irradiated single crystals
in α-aminoisobutyric acid and related α-amino acids by electron spin
resonance and SCF MO INDO calculation. J. Phys. Chem. 91:16881699. 1977.
[50] G. Vanhaelewyn. EPR-dosimetrie met Alanine. Master thesis, Laboratorium voor kristallogragie en studie van de vaste stof, Universiteit
Gent. 1996.
[51] www.bruker-biospin.com
[52] Operating Instructions Q-band Resonators ER5106 QTE/QTW/QT,
Bruker. v1.0
[53] P. Such. ER 5106 QT-Low Temperature Q-band Resonators. User’s
Manual. Bruker v1.0. 1994
[54] R. Clark en John Krc. Crystallographic Data. 59 L3-Threonine (Threoα-amino-β-hydroxy-n-butyric Acid). Anal. Chem. 24:1378. 1952.
[55] http://www.iucr.org/
[56] D. Poelman. Gevorderde XRD. Gedoceerd aan de master fysica en
sterrenkunde, Ugent Vakgroep Vastestofwetenschappen, academiejaar
2009-2010.
[57] P. Gong. Polytechnic Institute of New York, Brooklyn, New York, USA.
ICDD Grant-in-Aid. CAS Nummer: 74-19-5. 1980.
97
Bibliografie
[58] S. Stoll, A. Schweiger. EasySpin, a comprehensive software package
for spectral simulation and analysis in EPR. J. Magn. Res. 178:42-55.
2006.
[59] W. H. Nelson. Estimations of errors in eigenvalues and eigenvectors
from magnetic resonance results by use of linear data-fitting techniques.
J. Magn. Reson. 38:71-78. 1980.
[60] A. R. Soernes, E. Sagstuen en A. Lund. 14 N Quadrupole and hyperconjugative hyperfine coupling in 2-aminoethyl hydrogen sulfate Xirradiated at 295 K. Single crystal ENDOR analysis. UHF-INDO MO
calculations. J. Chem. Phys. 99:16867-16876. 1995.
[61] H. Vrielinck, H. De Cooman, M. A. Tarpan, E. Sagstuen, M. Waroquier
en F. Callens. Schonland ambiguity in the electron nuclear double resonance analysis of hyperfine interactions: Principles and practise. J.
Magn. Res. 195:196-205. 2008.
[62] D. S. Schonland. On the determination of principal g-values in electron
spin resonance. Proc. Phys. Soc. Lond. 73:788-792. 1959.
[63] J. Keysabyl. Bepaling van de g-tensoren van de dominante stabiele
stralingsgeı̈nduceerde radicalen in sucrose. Master thesis, Vakgroep
Vastestofwetenschappen, Universiteit Gent. 2010.
98