University of Groningen Bioconversion and combinatorial

University of Groningen
Bioconversion and combinatorial biosynthesis of selected terpenoids and lignans
Julsing, Mattijs Kamiel
IMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to
cite from it. Please check the document version below.
Document Version
Publisher's PDF, also known as Version of record
Publication date:
2006
Link to publication in University of Groningen/UMCG research database
Citation for published version (APA):
Julsing, M. K. (2006). Bioconversion and combinatorial biosynthesis of selected terpenoids and lignans s.n.
Copyright
Other than for strictly personal use, it is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the
author(s) and/or copyright holder(s), unless the work is under an open content license (like Creative Commons).
Take-down policy
If you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediately
and investigate your claim.
Downloaded from the University of Groningen/UMCG research database (Pure): http://www.rug.nl/research/portal. For technical reasons the
number of authors shown on this cover page is limited to 10 maximum.
Download date: 18-07-2017
Nederlandse Samenvatting
Bioconversie en combinatoriële biosynthese van geselecteerde
terpenoïden en lignanen
Farmaceutische biologie is het vakgebied dat de levende cel gebruikt als bron en producent
van geneesmiddelen. Lange tijd was het onderzoek van de farmaceutische biologie gericht
op het vinden en isoleren van nieuwe (biologisch actieve) verbindingen, met name uit
planten. De laatste decennia is de aandacht meer gericht op de biosynthese van
natuurstoffen en het ophelderen van de structuur en functie van de enzymen die bij de
biosynthese betrokken zijn. Het onderzoek richt zich ook op de bijbehorende genetische
informatie. De beschikbaarheid van recombinant DNA- technieken levert een schat aan
genetische informatie op over biosyntheseroutes. Tevens opent dezelfde techniek de
mogelijkheid om andere snelgroeiende cellen zoals bacteriën, gisten en schimmels, als
producent voor biosyntheseproducten uit hogere organismen te ontwikkelen.
Van oudsher is de mensheid geïnspireerd door de natuur voor wat betreft het vinden van
middelen om ziektes en kwalen te bestrijden of te verlichten. In onze maatschappij is de
relatie tussen geneesmiddelen en natuurstoffen vrijwel onzichtbaar en vaak wordt deze ten
onrechte geassocieerd met alternatieve geneeswijzen. Toch is een aanzienlijk deel van de
wereldbevolking anno 2006 afhankelijk van therapieën, waarbij die natuurlijke
geneesmiddelen van cruciaal belang zijn in verband met de beschikbaarheid en het
kostenaspect. In dit opzicht is de natuur nog steeds een bron voor het ontdekken en
ontwikkelen van nieuwe geneesmiddelen. De wetenschap die gebruik maakt van de kennis
van traditionele natuurlijke geneeswijzen voor het zoeken naar nieuwe geneesmiddelen
wordt etnofarmacologie genoemd. Ook bij de farmaceutische industrie, die altijd op zoek is
naar nieuwe verbindingen, is het besef meer en meer aanwezig dat de natuur een enorm
potentieel biedt voor het vinden van (uitgangsstoffen voor) nieuwe geneesmiddelen. Er zijn
grote programma’s waarin planten en dieren (met name mariene organismen) worden
verzameld en gescreend op biologisch actieve stoffen.
Door de opkomst van de chemie in de loop van de vorige eeuw is de aandacht van de
farmaceutische industrie voor een groot deel verschoven naar de oneindige mogelijkheden
die organische synthese leek te hebben voor het ontdekken van nieuwe geneesmiddelen.
Daarbij zijn inderdaad veel successen geboekt. Naast nieuwe geneesmiddelen kunnen
eenvoudige structuren die van oorsprong in planten voorkomen nu in het lab worden
gemaakt. Een bekend voorbeeld is salicylzuur uit de bast van de wilg. Deze eenvoudige
verbinding is de basis voor Aspirine®, dat in 1897 werd ontwikkeld en volledig chemisch
gemaakt wordt. Desalniettemin is de natuur de chemie regelmatig de baas. De complexiteit
en de specificiteit van de geïsoleerde verbindingen maken het vaak lastig om deze stoffen
chemisch na te maken, waardoor de chemische synthese niet rendabel is voor de producent.
Voor deze geneesmiddelen zijn we afhankelijk van de plant als leverancier. Voor sommige
geneesmiddelen, die in kleine hoeveelheden in de plant voorkomen of waarvan de plant
zeldzaam is, levert dit problemen op. Het gebruik van plantencelcultures kan in deze
gevallen soms een oplossing bieden. Hierbij worden cultures van plantencellen gebruikt om
specifieke omzettingen van verbindingen uit te voeren. Een mooi voorbeeld van de
toepassing van plantencelbiotechnologie is de productie van paclitaxel (Taxol®). Dit is een
- 130 -
Samenvatting
geneesmiddel dat gebruikt wordt in de chemotherapie bij verschillende vormen van kanker.
Paclitaxel werd oorspronkelijk geïsoleerd uit de bast van de boom Taxus brevifolia. De stof
komt echter in heel kleine hoeveelheden voor, waardoor er erg veel bomen werden gekapt.
Een voorloper van paclitaxel, baccatine III genaamd, komt echter in grotere hoeveelheden
in de naalden van verschillende Taxus-soorten voor. Hierdoor is het een duurzame bron
voor het geneesmiddel. Het baccatine III kan chemisch worden omgezet in paclitaxel, maar
plantencelcultures zijn ook in staat om paclitaxel te maken.
Een andere oplossing wordt ons geboden door moderne biotechnologische technieken. De
groeiende kennis omtrent biosyntheseroutes op eiwit- en genniveau maken het mogelijk
eenvoudige organismen, zoals bacteriën en gisten, te gebruiken als gastheercel voor de
productie van plantenstoffen. Door gebruik te maken van biosyntheseroutes die in de
gastheercel aanwezig zijn en/of door genen van verschillende oorsprong te combineren, kan
een plantenstof in een andere gastheercel worden gemaakt. Dezelfde strategie kan worden
gebruikt om nieuwe natuurproducten te vormen, waarbij enzymatische stappen worden
gekoppeld die in de natuur niet in hetzelfde organisme voorkomen. Het gebruik van deze
technieken tezamen wordt combinatoriële biosynthese genoemd. Dit proefschrift beschrijft
een aantal mogelijkheden en uitdagingen die deze techniek biedt.
In hoofdstuk 2 wordt een overzicht gegeven van de huidige kennis omtrent het gebruik van
combinatoriële biosynthese voor de productie van plantenstoffen. Hierbij is de nadruk
gelegd op verbindingen met een farmaceutische relevantie, zoals artemisinine, paclitaxel,
morfine, vinblastine en vincristine.
Bacillus subtilis is een Gram-positieve bacterie die reeds veelvuldig als een veilig
productieorganisme in de industrie wordt gebruikt. Net als alle levende cellen produceert B.
subtilis terpeenstructuren, die allemaal worden opgebouwd uit dezelfde C5-precursors IDP
en DMAPP. B. subtilis gebruikt deze stoffen voor de vorming van menaquinon, dat
betrokken is bij het elektronentransport in de cel. De endogene route zou gebruikt kunnen
worden voor de productie van terpenen uit planten door specifieke genen uit de planten
over te zetten in deze gastheercel. Om de productie van de endogene C5-precursor te
verhogen, is het van belang om eerst de genen die betrokken zijn bij de biosyntheseroute in
B. subtilis te identificeren. Op basis van het gegeven dat B. subtilis een deel van de
endogene precursor in zijn omgeving uitscheidt als isopreen, werd een methode ontwikkeld
om deze zeer vluchtige verbinding te detecteren in de lucht boven vloeibare
bacteriecultures. Hierbij is een gaschromatograaf gebruikt die iedere 15 minuten
automatisch luchtmonsters nam uit een afgesloten schudculture. Door genen die mogelijk
bij de biosynthese van isopreen betrokken zijn selectief uit te schakelen (door gebruik te
maken van zogenaamde knock-out stammen) en vervolgens de verschillen in
isopreenconcentraties in de lucht te meten, kon worden geconcludeerd of een gen al dan
niet betrokken is bij de biosynthese van terpenen. Gebruikmakend van deze methode
werden, op één na, alle genen in de biosynthesestappen tot de terpeenprecursors IDP en
DMADP geïdentificeerd. De resultaten van dit onderzoek zijn beschreven in hoofdstuk 3.
Een volgende stap voor het realiseren van de productie van plantenterpenen in een
bacteriecel is de expressie van een plantengen. De eerste specifieke omzetting van een
- 131 -
algemene precursor voor terpenen wordt gekatalyseerd door een zogenaamde
terpeencyclase. De gebruikte terpeencyclase, te weten amorfadieensynthase, komt uit de
biosyntheseroute van artemisinine. Dit is een terpeen dat gebruikt wordt tegen malaria,
vooral in gebieden waar resistentie tegen de gebruikelijke anti-malariamiddelen algemeen
voorkomt. Artemisinine wordt geïsoleerd uit de plant Artemisia annua. De kosten voor een
behandeling met artemisininederivaten, afkomstig uit planten, is voor veel landen waar
malaria voorkomt te duur om algemeen toe te kunnen passen. Daarom wordt naar
alternatieven gezocht voor een goedkopere productie van artemisinine. Een mogelijkheid
hiervoor is de productie in een micro-organisme door genen betrokken bij de biosynthese
over te zetten naar een gastheercel. Om meer te weten te komen over de werking en het
mechanisme van het enzym amorfadieensynthase, is het plantengen dat codeert voor dit
enzym tot expressie gebracht in Escherichia coli. Aan de hand van een computermodel van
de 3-dimensionale structuur van dit eiwit zijn mutanten gemaakt om de productspecificiteit
te bepalen. In de mutanten zijn veranderingen aangebracht door één of twee aminozuren (de
bouwstenen van eiwitten) te vervangen door een ander aminozuur (substitutie). Na
expressie van de genen werd de eiwitmutant gezuiverd uit de bacterie-extracten. Met
behulp van een assay werd vervolgens de activiteit van het oorspronkelijke eiwit en de
mutanten bepaald. De resultaten van dit onderzoek (beschreven in hoofdstuk 4) laten zien
dat de aangebrachte substituties niet resulteerden in de productie van andere
terpeenstructuren dan amorfa-4,11-dieen. De subtstutie naar alanine van sommige
aminozuren resulteerde in een complete inactivatie van het enzym. Hieruit kan
geconcludeerd worden dat de productspecificiteit wordt veroorzaakt door subtiele
structuurverschillen in de active site van het enzym. De opheldering van de kristalstructuur
van amorfadieensynthase zou deze verschillen kunnen aantonen.
Hoofdstuk 5 en 6 beschrijven twee andere mogelijkheden die combinatoriële biosynthese
biedt. Ten eerste is dat het derivatiseren van bestaande plantenverbindingen (hoofdstuk 5).
Metabolieten die normaal niet gevormd worden in de plant zouden nieuwe
(uitgangs)verbindingen voor geneesmiddelen kunnen opleveren. Een tweede mogelijkheid
is het nabootsen van een onbekend plantenenzym met een reeds bekend enzym (hoofdstuk
6). Dit zou het isoleren van het betreffende plantengen overbodig maken. Voor beide
doelstellingen is de mogelijkheid van het gebruik van cytochroom P450 enzymen uit de
menselijke lever onderzocht. CYP1A2, CYP2C9 en CYP3A4 zijn de drie leverenzymen die
meer dan 65% van alle geneesmiddelen in de lever metaboliseren. CYP3A4 neemt hiervan
het grootste deel voor zijn rekening. De genen voor deze drie enzymen zijn gecombineerd
met een cytochroom P450 NADPH-reductase gen tot expressie gebracht in E. coli.
Onderzocht is of bekende mono- en sesquiterpenen geïsoleerd uit planten konden worden
omgezet. Hierbij werden hele bacteriecellen gebruikt (bioconversie). CYP3A4 bleek
verschillende verbindingen te kunnen derivatiseren. Vervolgens is cedrol, een relatief veel
voorkomende natuurstof, als modelstof verder onderzocht. CYP3A4 zet cedrol om in twee
metabolieten. Deze metabolieten zijn geïsoleerd en vervolgens met behulp van
verschillende NMR-technieken en GC-MS geïdentificeerd als 2-hydroxycedrol en 4hydroxycedrol. Hiermee is aangetoond dat cytochroom P450 enzymen kunnen worden
gebruikt voor het omzetten van plantenverbindingen. Tevens geeft dit een beeld van het
metabolisme van dit soort verbindingen in de mens. De omzetting van de
terpeenverbindingen met humane cytochroom P450 enzymen is beschreven in hoofdstuk 5.
- 132 -
Samenvatting
Hetzelfde enzym CYP3A4 in E. coli is gebruikt om een plantenenzym na te bootsen. Voor
dit onderzoek is een verbinding uit een andere groep plantenstoffen, de lignanen, als model
gekozen. Podophyllotoxine is een lignaan uit Podophyllum hexandrum. Deze verbinding
heeft antivirale en cytotoxische activiteit. Podophyllotoxine wordt semisynthetisch
gederivatiseerd tot etoposide en tenoposide, die in de therapie bij verschillende vormen van
kanker worden gebruikt. Het gehalte aan podophyllotoxine in de wortels van de plant is
laag (ongeveer 4 % op basis van drooggewicht) en de plant is inmiddels zeldzaam
geworden door het intensieve oogsten. In de wortels van het algemeen voorkomende gewas
Anthriscus sylvestris, beter bekend als fluitenkruid, komt een biosynthetische voorloper
van podophyllotoxine, deoxypodophyllotoxine voor. Aangezien deze plant absoluut niet
zeldzaam is, kan er relatief gemakkelijk voldoende deoxypodophyllotoxine worden
geïsoleerd. Het enzym dat in P. hexandrum deoxypodophyllotoxine omzet in
podophyllotoxine is nog niet geïdentificeerd. Als alternatief voor het plantenenzym is
getracht dezelfde omzetting uit te voeren met een lever cytochroom P450. In hoofdstuk 6
wordt beschreven dat CYP3A4 deoxypodophyllotoxine omzet. De enige metaboliet die
ontstond is geïdentificeerd als epipodophyllotoxine, de stereo-isomeer van
podophyllotoxine. Aangezien de chemische derivatisatie van epipodophyllotoxine tot de
uiteindelijke cytostatica dezelfde eindproducten oplevert als podophyllotoxine, dus
ongeacht de stereochemie van de uitgangsstof, kan deze omzetting met CYP3A4 als
alternatief voor de omzetting in de plant worden ontwikkeld.
Een nadeel van het gebruiken van lever cytochroom P450 enzymen is dat ze door veel
verbindingen en gevormde producten worden geremd in hun activiteit. Dit is één van de
vele oorzaken van het ontstaan van interacties bij het gelijktijdig gebruiken van
verschillende medicijnen (farmacodynamische interactie). Ook van lignanen was reeds
bekend dat ze remming van CYP3A4 kunnen veroorzaken. Dit zou nadelig kunnen zijn
voor de in hoofdstuk 6 beschreven omzetting van deoxypodophyllotoxine.
In hoofdstuk 7 is de omzetting van deoxypodophyllotoxine in epipodophyllotoxine verder
onderzocht. Met behulp van een computermodel is aannemelijk gemaakt dat CYP3A4
voorkeur heeft voor de productie van epipodophyllotoxine boven podophyllotoxine.
Daarnaast is getracht een model voor de remming te laten zien. De resultaten van
hoofdstuk 7 tonen aan dat lignanen met een methyldioxy-ringstructuur, waaronder het
gevormde epipodophyllotoxine, de werking van het CYP3A4 remmen. Dit is onderzocht
door het effect te bekijken van het toevoegen van verschillende lignaanverbindingen aan
een enzymreactie met CYP3A4, waarbij het natuurlijke substraat testosteron door CYP3A4
wordt omgezet in 6β-hydroxytestosteron. De combinatie van experimenteel werk en
computermodelling zullen goed gebruikt kunnen worden bij het ontwikkelen van een
industriële toepassing voor de omzetting van deoxypodophyllotoxine naar
epipodophyllotoxine.
Concluderend kan gesteld worden dat bioconversie en combinatoriële biosynthese
belangrijke technieken zijn voor het onderzoek naar natuurstoffen. Dit zowel voor het
ophelderen van biosyntheseroutes als voor de heterologe productie en derivatisering van
secundaire metabolieten. Het gebruik van een micro-organisme als gastheer heeft als
voordeel dat deze vaak snel groeien, goedkoop zijn en te gebruiken zijn in een industriële
setting. Bij de expressie van plantengenen in de gastheercel kunnen echter ook problemen
- 133 -
optreden als vouwing van het enzym, oplosbaarheid van het enzym, gebrek aan
compartimentalisatie, ontbreken van modificaties en afbraak van het gevormde eiwit.
Daarnaast zal onderzoek moeten worden gedaan naar de regulatie en de lokalisatie van de
productie van een verbinding in de plant, aangezien dit in een gastheercel totaal
verschillend kan zijn. Directed evolution technieken, zoals random mutagenese, selectie en
in silico benaderingen (modellen met behulp van computerprogramma’s), zouden kunnen
worden toegepast voor het optimaliseren van de enzymen. Op deze manier zouden meer
efficiënte enzymen of enzymen met een nieuwe activiteit kunnen worden gecreëerd.
Hoewel de ontwikkeling van efficiënte heterologe productiesystemen voor plantenstoffen
nog in de kinderschoenen staat, zal verder onderzoek het in de nabije toekomst zeker
mogelijk maken om combinatoriële biosynthese strategieën te gebruiken voor het
ontwikkelen van alternatieve bronnen van lead compounds voor de farmacie. Dit zal
nieuwe geneesmiddelen kunnen opleveren en zeldzame planten kunnen redden van
uitsterven. Daarnaast zal het de kosten van de productie van sommige geneesmiddelen
kunnen verlagen.
- 134 -