BCR-ABL qPCR in een cartridge (Cepheid technologie)

CML en stoppen
moleculaire diagnostiek
Moderator
Dr. P. Kuiper-Kramer
1st author / speaker
Dr. Bert A. van der Reijden
[email protected]
Dept of Laboratory Medicine, Laboratory of Hematology
Radboud Institute for Molecular Life Sciences, Radboudumc
Conflict of Interest Disclosure Form
In accordance with the rules of the Health Care Inspectorate (IGZ)
Name:
Bert van der Reijden
Affiliation:
Radboudumc
☐
I have no potential conflict of interest to report

I have the following potential conflict(s) of interest to report
Type of affiliation / financial interest
Name of commercial company
Receipt of grants/research supports:
Receipt of honoraria or consultation fees:
Participation in a company sponsored speaker’s bureau:
Stock shareholder:
Other support (please specify):
Scientific advisory board
CML advisory board Novartis
BCR-ABL:
ABL is tyrosine
constitutieve
kinasefosforylering
ABL is cytoplasmatisch eiwit
Groeifactoren: activatie ABL
Fosforylatie bindingspartners
Celdeling , apoptose
ABL
ATP
p
Signaal tr eiwit
BCRABL ATP
Fosforylatie zonder groeifactor
p
Signaal tr eiwit
Toename celdeling
Apoptose remming
Therapie gericht op BCR-ABL
Imatinib lijkt op ATP, bindt ABL beter dan ATP
p
BCRABL
Imatinib
Signaal tr eiwit
Celdeling
Apoptose
10 jrs overleving van <50% naar ~90%
Tumorgrootte en reductie bij BCR-ABL positieve CML
Aantal cellen
Therapie (mnd)
1012
Diagnose
1011
3
1010
6
109 3*107
12 >12
Fusiegendetectie met PCR op cDNA (RNA) niveau
BCR
ABL
genomisch DNA
transcriptie en
RNA splicing
fusie mRNA
reverse transcriptie
fusie cDNA: RT-PCR
Primers
Polymerase, dNTPs, MgCl2
Genomisch DNA: breukpunten in grote intronen
maar 1 kopie per cel
RNA/cDNA:
RNA splicing: breukpunten bij elkaar
meerdere kopieen per cel
Kwantificeren BCRABL leukemiecellen met qPCR
BCR
ABL
cDNA
1 cyclus
2
2 cycli
4
3 cycli
8
UV
Q
4 cycli
16
n cycli
2n
R
Fluorescente DNA probe
R = reporter
Q = quencher
licht wordt geabsorbeerd
Degradatie fluorescente probe tijdens amplificatie
Q
R
exonuclease activiteit polymerase: destructie probe
Q
R
Geen absorptie licht
Gemeten tijdens PCR (real time)
Signaal = hoeveelheid PCR product
Kwantificeren BCRABL leukemiecellen met qPCR
BCR
ABL
cDNA
1 cyclus
2
2 cycli
4
3 cycli
8
4 cycli
16
n cycli
2n
Exponentiële toename
Signaal evenredig starthoeveelheid
qPCR amplificatieplot: toename signaal per cyclus
Fluorescent signaal
exponentiële fase
Drempelwaarde
0
PCR cycli
43
Signaal exponentiële fase correleert met oorspronkelijke cDNA concentratie
Kwantificering gebaseerd op calibratiereeks
Verdunningsreeks
0.01%
0.1%
1%
10%
cycli
100%
Bijv K562 cellijn
BCRABL sample
Vergelijk aantal
cycli met calibrator
cycli
qPCR normalisatie en voldoende input: referentiegen
Referentiegenen PBGD, GUS, ABL
Verdunningsreeks: normalisatie
Vaste cDNA input: gedefinieerd aantal cycli
1 cyclus meer: Q maal 2
1 cyclus minder: Q delen 2
Gevoeligheid: 1 op 100.000 gehaald?
BCRABL
internationale schaal (%)
Major molecular repons (MMR), MR4 en MR4,5 bij CML
100
Maximale
waarden
na Imatinib
10
3 mnd
1
6 mnd
0.1
12 mnd
MMR
MMar3
0.01
MR4
MR4,5
Zwak positief
Detectie limiet
100% IS: mediaan 3x30 BCRABL/BCR waarden
0.1% = major moleculaire respons
Tijd
Relatieve hoeveelheid samples
Uitstekende relatieve BCRABL kwantiteiten
0,1
0,09
n = 21 labs
Maximaal 4x hoger tov ref
Minimaal 4x lager tov ref
0,08
0,07
0,06
0,05
0,04
0,03
0,02
0,01
0
REF
10000-voudige verdunning tov 100-voudige BCRABL verdunning
Gemiddeld ref = 0,025 (40-voudige verdunning)
BCRABL niveau
Kinetiek zeer goed, absolute waarden sterk verschillend
Oorzaken
Referentiegen
Berekening
1 ipv 100
Correctie gewenst
BCRABL verdunning
Bepalen conversiefactor (CF)
Laboratorium A (centraal lab)
Laboratorium B (deelnemend lab)
30 patiëntensamples Lab B naar Lab A
Vergelijk data: conversiefactor
 BCR-ABL lokaal * CF = BCR-ABL IS
Iedere 2 jaar herhalen
Absolute waarden zeer vergelijkbaar naar conversie
BCR-ABL qPCR bewerkelijk, hoog afbreukgehalte
Poolen 3 buizen bloed
Leukocyten- en RNA isolatie
cDNA synthese
BCR-ABL qPCR sample
BCR-ABL qPCR calibratiereeks
qPCR normalisatiegen
Interpretatie resultaten
BCR-ABL qPCR in een cartridge (Cepheid technologie)
200 ul bloed
Lysis stap (10 min)
Pipetteer in cartridge
11 kamertjes
RNA isolatie
cDNA synthese
BCRABL qPCR
Normalisatie qPCR
Resultaat na 2,5 uur
Op Internationale Schaal
Sensitiviteit indien negatief
Efficiency Genexpert Cepheid vs BCRABL qPCR
Reductie “hands on” tijd (3:19 hrs vs 0:28 hrs)
Spaghetti diagram
Conv qPCR
Courtesy Nancy Boeckx, Leuven University
Spaghetti diagram
Cepheid
Conclusies BCRABL chronische myeloide leukemie
Monitoren therapierespons: BCRABL qPCR
BCRABL waarden op Internationale schaal
3 maanden na TKI: < 10%
6 maanden na TKI < 1%
12 maanden na TKI <0.1%
Cepheid technologie:
Geen conversiefactor nodig
Resultaat < 24 uur
Additionele ABL puntmutaties in BCRABL: resistentie
10% van patiënten resistentie
Vaak mutatie ATP-bindend domein BCRABL
Imatinib bindt niet meer, ATP wel: recidief
BCRp
ABL Imatinib
ATP
Bewijs werking middel
p
Signaal tr eiwit
Detectie ABL mutaties in BCRABL
BCR
ABL
cDNA
Amplificatie BCR-ABL: >10-3
Amplificatie tyrosinekinasedomein
Sanger sequencen
Resistent?
Puntmutatie Imatinib Nilotinib Dasatinib Ponatinib
L248V
Q252H
E255V
T315I
Ja
Ja
Ja
Ja
Nee
Nee
Ja
Ja
Nee
Ja
Nee
Ja
Nee
Nee
Nee
Nee
Resistentie: verlies Imatinib respons na initiële daling
BCRABL
internationale schaal (%)
100
10
1
Puntmutaties
meetbaar
boven MMR
0.1
0.01
Zwak positief
Detectie limiet
Time