Eerste experiment - Wetenschapsforum

-
Primer PPARG
Tm=60°C
o Forward primer: TCTGGGAGATTCTCCTATTGGC
o Reverse primer: CTGGAAGACAACTACAAGAG
-
Primer CD36
Tm=60°C
o Forward primer: AGT CCA GGT CAG GTG GAT TG
o Reverse primer: CCT CAG CAG GAA TAT TTC AGA GT
-
Primer KCNJ11
Tm=60°C
o Forward primer: TCATGCTACGTGTGGGTGAC
o Reverse primer: AGAGTGTGGCTGGTCAATCG
-
Primer TCF7L2
Tm=62°C
o Forward primer: GAACAATTAGAGAGCTAAGCACTTTTTAGAAAC
o Forward primer: GAACAATTAGAGAGCTAAGCACTTTTTAGAGAT
o Reverse primer: AGATGAAATGTAGCAGTGAAGTGC
Alle reagentia zijn van roche hier de referentiecodes
Buffer: 11 271 318 001
Taq polymerase: 11 146 173 001
dNTP: 11 581 295 001
Eerste experiment
vial
(l)
H2O
PCR buffer (met MgCl2 15mM)
10 x geconcentreerd
aanvullen tot 100
10
Forward primer
1
Reversed primer
1
uit bloed geëxtraheerd DNA
DNTP-mix 10mM each
100 ng toevoegen
2
Taq polymerase (5U/μL)
Programma PPARG, CD36, KCNJ11:
5 min 94°C  (40x) 40s 94°C, 40s 60°C, 40s 72°C
Programma TCF7L2
5 min 94°C  (40x) 40s 94°C, 40s 62°C, 40s 72°C
1
(later kwamen we erachter dat de extra elongation niet goed geprogrameerd was)
Tweede experiment
Vial A
(l)
H2O
PCR buffer (met MgCl2)
10 x geconcentreerd
aanvullen tot 100
Vial B
(l)
aanvullen tot 100
10
10
Forward primer
1
1
Reversed primer
1
1
uit bloed geëxtraheerd DNA
100 ng toevoegen
500 ng toevoegen
DNTP-mix 10mM each
2
2
Taq polymerase (5U/μL)
1
1
Aangezien er twijfels waren over het goed functioneren van de nanodrop omdat een groep
met toevoegen van extra DNA wel product kreeg is gekozen te testen met meer DNA
Programma PPARG, CD36, KCNJ11:
5 min 94°C  (40x) 40s 94°C, 40s 60°C, 40s 72°C
Programma TCF7L2
5 min 94°C  (40x) 40s 94°C, 40s 62°C, 40s 72°C
(later kwamen we erachter dat de extra elongation niet goed geprogrameerd was)
Derde Experiment
Vial A
(l)
H2O
PCR buffer (met MgCl2)
10 x geconcentreerd
aanvullen tot 100
Vial B
(l)
aanvullen tot 100
10
10
Magnesium 25 mM
-
3
Forward primer
1
1
Reversed primer
uit bloed geëxtraheerd DNA
1
200 ng toevoegen
1
200 ng toevoegen
DNTP-mix 10mM each
2
2
Taq polymerase (5U/μL)
.5
.5
Programma alle mutaties:
5 min 94°C  (40x) 40s 94°C, 40s 55°C, 40s 72°C  10 min 72°C  4°C
Resultaat:
Gel van het laatste experiment, voor de marker zit KCNJ11 (en blanco nr 5) en achter de
marker CD36 (en blanco nr 11)
En nr twee, voor de marker zit PPARG (en blanco nr 5) en na de marker eerst 2 monsters (4
laantjes) met de normale forward van TCF7L2 en daarna 2 monsters (4 laantjes) met de
tweede forward primer, en achteraan 2 blanco’s