Opmaak 1

Appendices
Nederlandse samenvatting
Eiwitten vormen een belangrijke categorie van farmaca die toegepast worden voor de
behandeling van chronische en levensbedreigende ziekten. Zo wordt bijvoorbeeld het
eiwithormoon insuline gebruikt voor de behandeling van suikerziekte. Ook worden
eiwitten in de vorm van vaccins toegediend aan met name kinderen en volwassenen
ter voorkoming van virale en bacteriële infecties. Vanwege hun ongunstige biofarmaceutische eigenschappen worden deze eiwitmoleculen bijna zonder uitzondering
via injecties aan patiënten gegeven. Dit is niet alleen pijnlijk voor de patiënt, maar ook
zijn hier nogal hoge kosten aan verbonden. Er is derhalve grote behoefte aan afgiftesystemen waarmee deze eiwitten via niet-invasieve routes aan patiënten kunnen worden toegediend. Aangezien eiwitten erg gevoelig zijn voor chemische en fysische
degradatieprocessen, moeten voor de vervaardiging van dergelijke afgiftesystemen
vaak bestaande technologieën geoptimaliseerd worden of compleet nieuwe ontwikkeld worden.
In dit proefschrift is onderzocht of TMC (tri-gemethyleerd chitosan) geschikt is voor
de bereiding van nasale en pulmonale toedieningsvormen voor therapeutische eiwitten en vaccins. TMC is een semi-synthetisch en wateroplosbaar polymeer dat verkregen wordt door chemische modificaties van chitine, een polysaccharide dat na
cellulose het meest voorkomende polymeer in de natuur is en geïsoleerd wordt uit het
exoskelet van o.a. garnalen. Dit polymeer hecht zich vanwege het kationogene karakter sterk aan het slijm waarmee epitheelcellen in onze neus en longen bedekt zijn.
Hierdoor wordt de verblijftijd van aan TMC gebonden eiwitten in de luchtwegen verlengd. Bovendien verhoogt TMC de permeabiliteit van neus- en longepitheel. Door
deze effecten kunnen therapeutische macromoleculen, die toegediend worden in combinatie met TMC, geabsorbeerd worden. Ook kunnen complete TMC-nanodeeltjes,
die beladen zijn met eiwitmoleculen, door cellen worden opgenomen en vervolgens
hun inhoud afgeven. In dit proefschrift zijn verschillende aspecten van TMC-eiwitformuleringen onderzocht.
Hoofdstuk 1 van dit proefschrift geeft een overzicht van de huidige literatuur van op
chitosan gebaseerde afgegiftesystemen voor toediening van eiwitten via niet-parenterale routes. De principes die ten grondslag liggen aan de nasale en pulmonale absorptie van eiwitten en/of cellulaire opname van met eiwit beladen deeltjes worden
bediscussieerd.
In Hoofdstuk 2 worden TMC-nanodeeltjes onderzocht als dragersysteem voor de
nasale toediening van eiwitten. Nanodeeltjes die beladen waren met het modeleiwit
ovalbumine en met een afmeting van ongeveer 350 nm, werden vervaardigd door al
roerende aan een waterige oplossing van TMC en ovalbumine, tripolyfosfaat toe te
voegen. Experimenten met luchtpijpen van kippenembryo’s en celcultures lieten weinig toxische effecten van deze deeltjes zien. Aangetoond werd dat nasaal toegediende
TMC-nanodeeltjes werden opgenomen door het epitheel en verder getransporteerd
werden naar de onderliggende cellagen. Deze studie toonde aan dat TMC-nanodeeltjes geschikte systemen zijn voor de nasale toediening van eiwitten.
181
Nederlandse samenvatting
In Hoofdstuk 3 wordt onderzocht of TMC-nanodeeltjes die beladen zijn met een influenza-antigeen in staat zijn een goede immuunrespons op te wekken. Nasale toediening van een waterige oplossing van het antigeen met en zonder TMC resulteerde
in een zeer geringe immuunrespons. Echter, zowel het intramusculair als nasaal toegediende antigeen dat ingebouwd was in TMC-nanodeeltjes met een afmeting van
ongeveer 800 nm, gaf een zeer sterke immuunreactie te zien.
In Hoofdstuk 4 staat de vervaardiging en karakterisering van met insuline beladen
TMC-microdeeltjes beschreven. Deze deeltjes werden verkregen door een oplossing
van TMC/insuline in DMSO/water te drogen met superkritisch CO2. Aangezien deze
microdeeltjes bedoeld zijn voor pulmonale toediening, is onderzocht of het middels
deze techniek mogelijk is deeltjes te verkrijgen met een geschikte aerodynamische afmeting onder behoud van de structuur van het eiwit. Het bleek dat deeltjes met een
geschikte grootte inderdaad vervaardigd kunnen worden en met een aantal geavanceerde technieken werd aangetoond dat het eiwit zijn structurele integriteit behouden heeft. Deze gunstige resultaten gaven aanleiding om deze formuleringen te testen
in diabetische ratten, waarvan de resultaten in Hoofdstuk 5 staan beschreven. Pulmonale toediening van de met insuline beladen TMC-microdeeltjes resulteerde in
een significante systemische insuline-absorptie. Voor één formulering werd zelfs een
relatieve biologische beschikbaarheid van 0,97 gevonden ten opzichte van subcutaan
toegediend insuline. Het geabsorbeerde insuline was biologisch actief, hetgeen resulteerde in een sterke verlaging van de bloedsuikerspiegel. Histologische analyses
lieten geen acute onstekingsreacties of andere toxische effecten zien.
Hoofdstuk 6 beschrijft een studie over de pulmonale toediening van TMC-microdeeltjes die beladen zijn met difterietoxoïd (DT), een modelantigeen. De met eiwit beladen deeltjes werden vervaardigd door droging van een oplossing van DT en TMC
in water gebruikmakend van superkritisch CO2. Deze deeltjes hadden de goede aerodynamische afmetingen en gaven na pulmonale toediening aan hamsters zowel een
sterke lokale als een systemische immuunrespons te zien. De gevonden immuunrespons was zelfs sterker dan die werd waargenomen na intramusculaire toediening van
een standaard DT-formulering.
Samenvattend kan geconcludeerd worden dat de studies die beschreven staan in dit
proefschrift hebben aangetoond dat op TMC gebaseerde nano- en microdeeltjes veelbelovende systemen zijn voor de toediening van therapeutische eiwitten en vaccins
via niet-invasieve toedieningsroutes.
182