basistechnieken van de recombinant-DNA-technologie
advertisement
basistechnieken van de recombinant-DNA-technologie Deel 2 door Peter Roels Monitoraat Wetenschappen K.U. Leuven basistechnieken van de recombinant-DNA-technologie • • • • • • • DNA-dubbelhelix inleiding: 3 pijlers restrictiefragment-lengtepolymorfisme Southern-vlektechniek genkloning polymerase-kettingreactie DNA-sequentiebepaling polymerase-kettingreactie DNA-dubbelhelix DENATURATIESTAP 92°C enkelstrengs DNA RENATURATIESTAP 40-60°C enkelstrengs DNA + primer 5’...ATTCGCTCGCAATATAGATCTC 3’ 3’ GCGTTATATCTCGAG 5’ polymerase-kettingreactie DNA-dubbelhelix DENATURATIESTAP 92°C enkelstrengs DNA RENATURATIESTAP 40-60°C enkelstrengs DNA + primer POLYMERISATIESTAP 72°C bijna voltooide DNAdubbelhelices polymerase-kettingreactie 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ nieuwe streng 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ polymerase-kettingreactie 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ nieuwe streng 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ polymerase-kettingreactie polymerase-kettingreactie polymerase-kettingreactie polymerase-kettingreactie polymerase-kettingreactie cyclus gewenste fragmenten totaal aantal ds % gewenst/totaal 1 0 2 0 2 0 4 0 3 2 8 25 4 8 16 50 … 20 30 1.048.536 1.048.576 > 99,9 1.073.741.764 1.073.741.824 >>99,9 polymerase-kettingreactie: meer over primers… binding 5’ …GCGGTGCAAG… 3’ CACGT 3’ temperatuur geen 50°C 5’ 5’ …GCGGTGCAAG… 3’ CACGT 3’ 5’ specifiek 45°C 5’ …GCGGTGCAAG… 3’ CACGT 3’ 5’ aspecifiek 40°C polymerase-kettingreactie: meer over primers… 5’ …GCGGTGCAAG… 3’ CACGT 5’ 3’ …GCGATGCAAG… 5’ 3’ …GCGGTGCGAG… CACGT CACGT 3’ 5’ complementair polymerisatie niet 3’ complementair 5’ aan 3’-einde primer geen polymerisatie niet 3’ complementair 5’ aan 5’-einde primer polymerisatie PCR versus celkloning PCR Celkloning snel, makkelijk omslachtig in principe vanaf 1 cel voldoende uitgangsmateriaal nodig PCR versus celkloning PCR Celkloning snel, makkelijk omslachtig in principe vanaf 1 cel voldoende uitgangsmateriaal nodig kennis sequentie flankerende gebieden nodig geen a priori kennis sequentie nodig relatief korte fragmenten lange fragmenten basistechnieken van de recombinant-DNA-technologie • • • • • • • DNA-dubbelhelix inleiding: 3 pijlers restrictiefragment-lengtepolymorfisme Southern-vlektechniek genkloning polymerase-kettingreactie DNA-sequentiebepaling DNA-sequentiebepaling: reacties 5’ ACCGTGACGAT 3’ TGGCACTGCTA stop A stop C stop G 3’ 5’ stop T stop A DNA-sequentiebepaling: reacties 5’ ACCGTGACGAT 3’ 3’ TGGCACTGCTA 5’ 5’ ACCGTGACGAT 3’ 3’ TGGCACTGCTA 5’ + polymerase nucleotiden (A, C, G, T*) primer (5’ ACCG 3’) stopnucleotide stop A A 5’ ACCGTGACGAT 3’ 3’ TGGCACTGCTA 5’ stop A 5’ ACCGTGACGAT 3’ 3’ TGGCACTGCTA 5’ 5’ ACCGTGACGAT 3’ 3’ TGGCACTGCTA 5’ 5’ ACCGTGACGAT 3’ 3’ TGGCACTGCTA 5’ 5’ ACCGTGACGAT 3’ 5’ ACCGTGACGAT 3’ 5’ ACCGTGACGAT 3’ 5’ ACCG 3’ 3’ TGGCACTGCTA 5’ 5’ ACCG 3’ 3’ TGGCACTGCTA 5’ 5’ ACCG 3’ 3’ TGGCACTGCTA 5’ 5’ ACCGTGA 3’ 3’ TGGCACTGCTA 5’ 5’ ACCGTGACGA 3’ 3’ TGGCACTGCTA 5’ 5’ ACCGTGACGAT 3’ 3’ TGGCACTGCTA 5’ stop A 5’ ACCGTGACGAT 3’ 3’ TGGCACTGCTA 5’ 5’ ACCGTGACGAT 3’ 3’ TGGCACTGCTA 5’ 5’ ACCGTGACGAT 3’ 3’ TGGCACTGCTA 5’ 5’ ACCGTGACGAT 3’ 5’ ACCGTGACGAT 3’ 5’ ACCGTGACGAT 3’ 5’ ACCG 3’ 3’ TGGCACTGCTA 5’ 5’ ACCG 3’ 3’ TGGCACTGCTA 5’ 5’ ACCG 3’ 3’ TGGCACTGCTA 5’ 5’ ACCGTGA 5’ ACCGTGACGA 5’ ACCGTGACGAT 3’ 3’ 3’ DNA-sequentiebepaling: reacties stop A DNA-sequentiebepaling: elektroforese stopstop A Astopstop C C stopstop G G stopstop T T - + stop A stop C stop G stop T DNA-sequentiebepaling: interpretatie 5’ ACCGT stop A stop C stop G stop T DNA-sequentiebepaling: interpretatie 5’ ACCGTG stop A stop C stop G stop T DNA-sequentiebepaling: interpretatie 5’ ACCGTGA stop A stop C stop G stop T DNA-sequentiebepaling: interpretatie 5’ ACCGTGAC stop A stop C stop G stop T DNA-sequentiebepaling: interpretatie 5’ ACCGTGACG stop A stop C stop G stop T DNA-sequentiebepaling: interpretatie 5’ ACCGTGACGA stop A stop C stop G stop T DNA-sequentiebepaling: interpretatie 5’ ACCGTGACGA? 3’ stop A stop C stop G stop T DNA-sequentiebepaling: interpretatie 5’ ACCGTGACGA? 3’ 3’ TGGCACTGCT? 5’ stop A stop C stop G stop T DNA-sequentiebepaling: cycle sequencing simulatie http://www.dnalc.org/resources/BiologyAnimationLibrary.htm DNA-sequentiebepaling: cycle sequencing