Elektroforese

Identificatie van nieuwe celdood
mediatoren via RNAi
Annelies Vervaeke
Farmaceutische en biologische laboratoriumtechnologie
Stagementor: Sasker Grootjans
Lector: Anneleen Cottyn
2012-2013
2
Inhoud
1. Geprogrammeerde celdood
2. Doelstelling
3. Resultaten en discussie
4. Besluit
3
1. Geprogrammeerde celdood
4
Inhoud
1. Geprogrammeerde celdood
2. Doelstelling
2.1. ‘Knock-down’ a.d.h.v. miRNA constructen
2.2. Lentivirale overdracht
2.3. Kloneren van de pLenti expressie vector
3. Resultaten en discussie
4. Besluit
5
2. Doelstelling
2.1. ‘Knock-down’ veroorzaakt door miRNA constructen
‘Post Transcriptional Gene Silencing (PTGS)’ mechanisme  translatie gen
6
2. Doelstelling
2.2. Lentivirale overdracht
Transfectie
‘packaging’ vector
enveloppe vector
Toegepaste technieken
TNF/FasL
‘Knock-down’ target mRNA
Meten effect van ‘knock-down’ op
(caspase-activatie bij):
Apoptose
Necroptose
7
2. Doelstelling
2.3. Kloneren van de pLenti6 expressie vector
Met pDEST = destinatie vector
pENTR = ‘entry’ vector
Plaatsgerichte
mutagenese
T4-ligatie
‘Insert’ (dsDNA)
BalI
BsmBI
+
BsmBI
8
2. Doelstelling
2.3. Kloneren van de pLenti6 expressie vector
Gen
A
B
C
D
E
Nummer van het primerpaar geligeerd in
de pLenti expressie vector
 Verwijst eveneens naar het construct
1
2
3
4
5
6
7
8
9
9
Inhoud
1. Geprogrammeerde celdood
2. Doelstelling
3. Resultaten en discussie
3.1. Controleren van de plaatsgerichte mutagenese
3.2. Controleren van de T4-ligatie
3.3. Controleren van de LR-reactie
4. Besluit
10
3. Resultaten en discussie
Plaatsgerichte mutagenese
BsmBI-digest (controle)
Open knippen vector
11
3. Resultaten en discussie
3.1. Controleren van de plaatsgerichte mutagenese
-
BsmBI-digest
-
Resultaat: de ongewenste knipplaats is overal verwijderd
3138 bp
12
3. Resultaten en discussie
Plaatsgerichte mutagenese
BsmBI-digest (controle)
Annealen primers
tot dsDNA
Open knippen vector
T4-ligatie
Transformatie
Controle-PCR
Controle-digest
13
3. Resultaten en discussie
3.2. Controleren van de T4-ligatie
3.2.1. Kolonie-PCR
-
Éénzelfde primerpaar
-
Resultaat:
 elk ‘insert’ is opgenomen
 weinig zelfsluiting (controle bij transformatie)
140 bp
140 bp
14
3. Resultaten en discussie
3.2. Controleren van de T4-ligatie
3.2.2. Digest
- DraI  2 ≠ banden
- Resultaat: weinig onderlinge ligatie van plasmiden
2383bp
755bp
SmartLadder: I=10 000bp, II=5000bp, III=3000bp, IV= 2500bp, V=2000bp, VI=1000bp, VII=800 en VIII=600bp
15
3. Resultaten en discussie
Plaatsgerichte mutagenese
BsmBI-digest (controle)
Annealen primers
tot dsDNA
Open knippen vector
T4-ligatie
Transformatie
Controle-PCR
LR-recombinatie
Transformatie
Controle-digest
Controle-PCR
Construct?
Controle-digest
16
3. Resultaten en discussie
3.2. Controleren van de LR-recombinatie
3.2.1. Kolonie-PCR
- Éénzelfde primerpaar
- Kleine kolonies (laan E-H) en grote kolonies (laan A-D) per getransformeerde plaat testen
- Resultaat: elk ‘insert’ is opgenomen
500 bp
500 bp
17
3. Resultaten en discussie
3.2. Controleren van de LR-recombinatie
3.2.2. Digest
-
Kleine kolonies (laan H en G) en een grote kolonie (laan D)
(allen positief na kolonie-PCR) per getransformeerde plaat testen
- BalI  2 ≠ banden
-
Resultaat: incorrecte onderlinge recombinaties
2383 bp
755 bp
Met: C=controle en S=‘scrambled’ controle
SmartLadder:10 000bp, II=8000bp, III=6000bp, IV=5000bp, V=4000bp, VI=3000bp, VII=2500, VIII=400bp
en IX=200bp
18
Inhoud
1. Geprogrammeerde celdood
2. Doelstelling
3. Resultaten en discussie
4. Besluit
19
4. Besluit
Meten effect van ‘knock-down’ op
(caspase-activatie bij):
Apoptose
Necroptose
‘packaging’ vector
enveloppe vector
TNF/FasL
‘Knock-down’ target mRNA
20
4. Besluit
• Laatste ontwikkelingen in het onderzoek
- Nieuwe mediator  gen D (construct 7) = celdood inhibitor
- ‘European Bioinformatics Institute’ (EBI)
 In sommige kankertypes, overexpressie van gen D
- Verder in vitro en in vivo onderzoek
 Mogelijks een target voor de ontwikkeling van behandelingen tegen
aandoeningen (kanker, hart- en herseninfarcten…)
Identificatie van nieuwe celdood
mediatoren via RNAi
Annelies Vervaeke
Farmaceutische en biologische laboratoriumtechnologie
Stagementor: Sasker Grootjans
Lector: Anneleen Cottyn
2012-2013
Cell death assays: enzymatic
- MTT assay
- Lactate dehydrogenase
NAD+
NADH + H+
NAD+
Diaphorase
LDH
Iodonitrotetraformazan
Lactate
Pyruvate
Iodonitrotetrazolium chloride
Cell death assays: DNA dyes
- Flow cytometer
1000 fold
intensity shift
Live
Dead
- BD Pathway
OR
Live
Dead-necrosis
Dead-apoptosis
New cell death assay: Fluostar
1000 fold
intensity shift
Sytox green: intensity shift after DNA binding
Plate
reader
well): cell death
Can be
used(96
to identify
•No
Temperature
incubator (37°C)
metabolic bias
• Reads Fluorescence Intensity
•Top/bottom reading
•8 sequential filter combinations
•15 sec per filter (entire plate)
•10 min entire plate, 8 filters
•Problem for mamalian cells:
•C02-conditioned medium
• Use CO2-independent medium (Leibovitz)
•Evaporation
•Leave lid on plate, use bottom reading
Cell death on fluostar
Sytox Green: Ex 480nm, Em 540nm
L929 fibrosarcoma:
TNF = necrosis
Fas = apoptosis
60000
50000
40000
30000
control
20000
TNF
10000
Fas
Ac-DEVD-AMC (7-Amino-4-methylcoumarin)
Ex.: 340-360nm, Em.: 440-460nm
0
0
1.5
3
4.5
6
7.5
9
10.5
12
13.5
15
16.5
CASP3
Cell death (Sytox green
intensity)
Cell death L929-sA-hFas
Caspase activationL929-sAhFas
200000
DEVD
DEVD
AMC
AMC
150000
100000
control
50000
TNF
0
Fas
0
1.5
3
4.5
6
7.5
9
10.5
12
13.5
15
16.5
Casp activity (DEVD-mca
intensity)
Hours post stimulus
Hours post stimulus
Sytox green + DEVD-amc:
- Reproducible cell death
kinetics
- Discrimination between
apoptosis & necrosis
Cell death assays: overview
Flow
Cytometer
BD Pathway
Fluostar
MTT-assay
Principle
Membrane
Membrane
Membrane
Mitochondrial
impermeable dye impermeable dye impermeable dye activity
Time required
96 well: 30 min1h
96 well: 45 min
96 wel: 10 min
96 wel: 4 hoursovernight
High
throughput
1 plate for each
timepoint
1 plate for 2
timepoints
(toxicity laser)
1 plate for all
timepoints
1 plate per
timepoint
Endpoint/
continuous
endpoint
Semi-continuous
continuous
endpoint
Cell death
type
identification
Only for reporter
cell lines
Nuclear shrinking Caspase
& chromatin
activation
condensation
Not possible
Single
cell/population
Single cell ->
population
Single cell ->
population
population
population