HLA typeren en HLA antistoffen t.b.v. trombocytentransfusies

Regionale Themamiddag Bloedtransfusie
C. Voorter
27-03-2014
HLA typeren en HLA antistoffen
t.b.v. trombocytentransfusies
Christien Voorter
Transplantatie-Immunologie,
Laboratorium Weefseltypering
c,[email protected]
Regionale Themamiddag Bloedtransfusie
C. Voorter
27-03-2014
HLA
• Humaan Leucocyt Antigeen
• Eiwitten op oppervlakte van de cel
• Polymorf (veel verschillende soorten)
• Rol bij immunologische reacties
Afweer tegen lichaamsvreemde stoffen
zoals virussen, bacterien
2
Regionale Themamiddag Bloedtransfusie
C. Voorter
27-03-2014
3
HLA systeem
* Bloedgroepsysteem op witte bloedcellen, maar ook op vrijwel
alle kernhoudende cellen en bloedplaatjes
* Veel polymorfer dan rode bloedgroepen:
ABO systeem 4 mogelijke combinaties
HLA systeem meer dan 1 miljoen combinaties
* ABO: natuurlijk aanwezige antistoffen
HLA: antistoffen alleen na contact met vreemde HLA antigenen
Regionale Themamiddag Bloedtransfusie
C. Voorter
27-03-2014
4
HLA genen
Chromosoom 6
DP
DQ
DR
B
B
B
A
A
klasse II
B
C
A
klasse I
A
Regionale Themamiddag Bloedtransfusie
C. Voorter
27-03-2014
5
HLA klasse I molecuul
A/B/C
C6
C15
beta-2microglobuline
HLA klasse I moleculen: expressie
op alle kernhoudende cellen en
trombocyten
Regionale Themamiddag Bloedtransfusie
C. Voorter
27-03-2014
6
HLA klasse II molecuul
DRA/DQA/DPA
C6
DRB/DQB/DPB
C6
HLA klasse II moleculen: expressie op B-lymfocyten,
macrofagen, dendritische cellen, endotheelcellen en
geactiveerde T-cellen
7
Regionale Themamiddag Bloedtransfusie
C. Voorter
27-03-2014
Structuur HLA molecuul
8
Regionale Themamiddag Bloedtransfusie
C. Voorter
27-03-2014
Structuur HLA molecuul
9
Regionale Themamiddag Bloedtransfusie
C. Voorter
27-03-2014
10
viral protein
virus
cytotoxic
HLA class I /viral peptide
recognition
CD8+ Tcell
Regionale Themamiddag Bloedtransfusie
C. Voorter
27-03-2014
11
HLA-A variatie
Aa Aa Aa Aa Aa Aa Aa Aa Aa AA
Aa Aa Aa Aa Aa Aa A a Aa Aa Aa Aa
Aa Aa AA Aa Aa Aa Aa Aa Aa Aa Aa
Aa Aa Aa Aa Aa Aa Aa Aa Aa Aa Aa Aa
Aa Aa Aa Aa Aa Aa  Aa Aa Aa
Aa Aa Aa Aa Aa Aa Aa Aa Aa Aa Aa
Aa Aa AA Aa Aa Aa Aa Aa Aa  Aa
Aa
Regionale Themamiddag Bloedtransfusie
C. Voorter
27-03-2014
12
HLA polymorfisme herkent
verschillende peptides
Virale eiwitten
Virale peptide
HLA-A1
+
HLA-A2
+
HLA-A3
+
HLA-A11
-Response
Regionale Themamiddag Bloedtransfusie
C. Voorter
27-03-2014
Polymorfisme HLA
Aantal allelen per locus
January 2003
A
266
B
511
C
128
DRB
328
DQB1
53
DPB1
101
C
2133
DRB
1512
DQB1
509
DPB1
248
January 2014
A
2579
B
3285
13
Regionale Themamiddag Bloedtransfusie
C. Voorter
27-03-2014
Trombocyten transfusie
?
?
HLA-A, HLA-B
14
Regionale Themamiddag Bloedtransfusie
C. Voorter
27-03-2014
15
Trombocyten transfusie
HLA identiek
HLA niet acceptabel
HLA acceptabel
HLA antistoffen?
Regionale Themamiddag Bloedtransfusie
C. Voorter
27-03-2014
HLA bepalingen tbv
trombocytentransfusies
HLA typeren:
HLA overeenkomst donor en patiënt
HLA antistoffen:
aan- en afwezigheid
specificiteit
16
Regionale Themamiddag Bloedtransfusie
C. Voorter
27-03-2014
HLA typering
Serologie: bepaalt HLA moleculen op het cel oppervlak
DNA typering: bepaalt HLA gen informatie
17
Regionale Themamiddag Bloedtransfusie
C. Voorter
27-03-2014
18
Serologische HLA typering
Te typeren individu
lymphocytes
many different sera
anti-HLA
antibodies
Regionale Themamiddag Bloedtransfusie
C. Voorter
27-03-2014
CDC: Complement Dependent
Cytotoxicity
19
Regionale Themamiddag Bloedtransfusie
C. Voorter
27-03-2014
Serologische HLA typering
negatieve reactie
positieve reactie
20
Regionale Themamiddag Bloedtransfusie
C. Voorter
27-03-2014
21
Moleculaire HLA typering
• lage resolutie
SSP = sequentie specifieke primer amplificatie
SSO = sequentie specifieke oligo hybridisatie
• hoge resolutie
SBT = sequence based typing (nucleotide volgorde)
Regionale Themamiddag Bloedtransfusie
C. Voorter
27-03-2014
22
PCR-SSP
5’
3’
PCR product
3’
5’
5’
3’
geen PCR product
3’
5’
3’ mismatch
+
IC
M
-
Regionale Themamiddag Bloedtransfusie
C. Voorter
27-03-2014
23
PCR-SSO (Luminex technology)
Regionale Themamiddag Bloedtransfusie
C. Voorter
27-03-2014
Assays
HLA ANTISTOF BEPALING
LUMINEX SINGLE ANTIGENS
HLA TYPERING
PCR-SSO
24
Regionale Themamiddag Bloedtransfusie
C. Voorter
27-03-2014
PCR-SSO (Luminex)
DNA
bio
PE
BEAD 2
probe 2
rode laser: identificatie bead (probe)
groene laser: detectie DNA binding
25
Regionale Themamiddag Bloedtransfusie
C. Voorter
27-03-2014
Sequence based typing
26
Regionale Themamiddag Bloedtransfusie
C. Voorter
27-03-2014
27
Resolutie van HLA typering
en naamgeving
serologisch
A24
molecuul
DNA lage resolutie
A*24
allelgroep
DNA intermediair
A*24 AMJ
allelgroepcluster
A*24 CGMH
DNA hoge resolutie
A*24:02:01:02 N
alleldefinitie
Regionale Themamiddag Bloedtransfusie
C. Voorter
27-03-2014
28
Nomenclatuur
typering
op DNA
proteïn
geeft verschillen aan
in niet-coderend
gebied (intron)
HLA – A * 24 : 02 : 01 : 02 N
gen
allel
groep
synonieme
substitutie in
het coderend
gebied
geeft verandering
in expressie aan
L = lage expressie
N = nul allel
Regionale Themamiddag Bloedtransfusie
C. Voorter
27-03-2014
29
HLA antistoffen
Vorming na contact met vreemde HLA antigenen:
- zwangerschap
- bloedtransfusie
- transplantatie
Vastgesteld mbv verschillende technieken:
- Elisa
- CDC
- flow cytometrie (Luminex)
Regionale Themamiddag Bloedtransfusie
C. Voorter
27-03-2014
30
HLA antistoffen
Aanwezigheid: er zijn wel of geen antistoffen aanwezig
Elisa
Specificiteit:
antistoffen herkennen een bepaald
antigen, bv A1, B12, DR13 etc
%PRA kan worden doorgegeven
CDC screening
Luminex Single Antigens
Regionale Themamiddag Bloedtransfusie
C. Voorter
ELISA
27-03-2014
31
Regionale Themamiddag Bloedtransfusie
C. Voorter
27-03-2014
32
Luminex Single Antigen assay
recipient
blood
serum
+
+
Anti-IgG-PE
Regionale Themamiddag Bloedtransfusie
C. Voorter
27-03-2014
Luminex Single Antigen assay
Commercial assays including the use of single antigen beads
(Luminex) although the conformation of these molecules may be
different than that of membrane bound HLA molecules.
HLA-A1
HLA-A2
HLA-A3
HLA-B7
33
Regionale Themamiddag Bloedtransfusie
C. Voorter
27-03-2014
Specificity HLA antibodies
> 4000
34
Regionale Themamiddag Bloedtransfusie
C. Voorter
27-03-2014
35
Trombocyten transfusie
HLA identiek
HLA niet acceptabel
HLA acceptabel
HLA antistoffen?
Regionale Themamiddag Bloedtransfusie
C. Voorter
27-03-2014
36
Trombocyten transfusie
HLA identiek
HLA niet acceptabel
A2, 24, 33, 34, 68, 69
HLA acceptabel
A1, 3, 11, etc
HLA antistoffen
A2, 24, 33, 34, 68, 69
Regionale Themamiddag Bloedtransfusie
C. Voorter
27-03-2014
37
Transplantatie Immunologie
Laboratorium Weefseltypering
Niertransplantaties
Stamcel transplantaties
HLA typeren
Autoloog/familie/ongerelateerd (MUD)
* Ontvangers en evt hun familieleden
HLA typeren
* Donoren (postmortale en levende)
HLA antistofbepalingen
HLA antistofbepalingen
Searchen en bepalen matchingsgraad donoren
Kruisproeven
Chimerismebepaling na transplantatie
Adviezen t.a.v. transplantatiemogelijkheden
Associaties HLA met ziekte
Trombocytensupport
•
•
•
•
HLA typeren
Coeliakie
Bechterev (ankylosing spondylitis)
HIV-medicatie (abacavir)
Etc
HLA antistofbepalingen
Onderzoek
Regionale Themamiddag Bloedtransfusie
C. Voorter
27-03-2014
38
Transplantation Immunology
Tissue Typing Laboratory
Prof. Dr. Marcel G.J. Tilanus
Office
- Diana van Bakel
•
•
Molecular Immunology
- Dr. Christien Voorter
- Lisette Groeneveld
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Kevin Gerritsen
Timo Olieslagers
Veerle Crijns
Fausto Palusci
Maud Limpens
Christel Meertens
Stefan Molenbroeck
Sophie Onclin
Veronique Vastmans
Kim Beekers
Bio-informatics
- Dr. Mathijs Groeneweg
Mieke Haemers
Audrey van den Berg
Cellular immunology
- Dr. Lotte Wieten
• Ilse Houba
• Fabienne Jeukens
Serology
-
Dr. Joris Vanderlocht
Dr. Jennifer Schellekens
Sandra Piederiet
Coline van Groesen
•
•
•
•
•
•
Thomas Habets
Marjolijn van Tuijl
Els Bielen
Jacqueline Frijns
Annette Rombach
Esther Schaepkens