UvA-DARE (Digital Academic Repository) Nonclassical ligands for

UvA-DARE (Digital Academic Repository)
Nonclassical ligands for the thyrotropin receptor: functional studies on thyrostimulin
and Graves’ disease immunoglobulins
van Zeijl, C.J.J.
Link to publication
Citation for published version (APA):
van Zeijl, C. J. J. (2011). Nonclassical ligands for the thyrotropin receptor: functional studies on thyrostimulin and
Graves’ disease immunoglobulins
General rights
It is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the author(s) and/or copyright holder(s),
other than for strictly personal, individual use, unless the work is under an open content license (like Creative Commons).
Disclaimer/Complaints regulations
If you believe that digital publication of certain material infringes any of your rights or (privacy) interests, please let the Library know, stating
your reasons. In case of a legitimate complaint, the Library will make the material inaccessible and/or remove it from the website. Please Ask
the Library: http://uba.uva.nl/en/contact, or a letter to: Library of the University of Amsterdam, Secretariat, Singel 425, 1012 WP Amsterdam,
The Netherlands. You will be contacted as soon as possible.
UvA-DARE is a service provided by the library of the University of Amsterdam (http://dare.uva.nl)
Download date: 19 Jul 2017
SAMENVATTING
SAMENVATTING
176
Schildklierstimulerend hormoon (thyroid stimulating hormone, TSH), het klassieke
ligand voor de TSH receptor (TSHR), speelt een belangrijke rol in de regulatie van de
aanmaak van schildklierhormonen via binding aan en activatie van de TSHR in de
schildklier. Naast TSH bestaan er verschillende typen ‘niet-klassieke’ liganden voor de
TSHR. Deze kunnen, net als TSH, een agonistische werking hebben en na binding de
receptor stimuleren, of ze kunnen een antagonistische werking hebben en de receptor
blokkeren voor actie van TSH. In dit proefschrift hebben we drie niet-klassieke TSHR
liganden bestudeerd. In de hoofdstukken 2 tot en met 6 beschrijven we studies naar
de rol van thyrostimuline in de hypothalamus-hypofyse-schildklier (HPT) as tijdens
verschillende condities in muizen. In de hoofdstukken 7 tot en met 9 bespreken we
in vitro experimenten met immunoglobulines type G die circuleren bij de ziekte van
Graves (GD-IgG). We hebben ons geconcentreerd op de mogelijke rol van deze GD-IgG
in orbitale fibroblasten van patiënten met Graves’ ftalmopathie (GO). In hoofdstuk 9
hebben we gebruik gemaakt van een TSHR-antagonist met een laagmoleculaire massa
(LMW), ontwikkeld door MSD (Oss, Nederland).
Hoofdstuk 1 begint met een inleiding over de stuctuur en functie van de TSHR en
zijn verschillende liganden. De signaaltransductie en (patho)fysiologische rollen van
thyrostimuline en GD-IgG worden ingeleid. Verder wordt behandeld dat de TSHR ook
buiten de schildklier in het lichaam tot expressie wordt gebracht (zoals wit en bruin
vetweefsel, spieren en orbitale fibroblasten) en ook daar een functionele rol kan spelen.
Thyrostimuline
Thyrostimuline werd in 2002 ontdekt en is, net als TSH, een glycoproteïne hormoon.
Het bestaat uit twee glycoproteïne hormoonsubunits: GPA2 en GPB5. Hoewel beide
subunits in de hypofyse tot expressie komen en thyrostimuline de TSHR stimuleert,
zijn er steeds meer aanwijzingen dat thyrostimuline geen essentiële rol speelt in de
klassieke negatieve feedback regulatie van de HPT as. De functie van dit hormoon is dan
ook nog grotendeels onopgehelderd. Er is zelfs discussie over de vraag of thyrostimuline
als heterodimeer functioneert omdat GPA2 en GPB5 wellicht afzonderlijke functies
hebben. Om de rol van thyrostimuline te kunnen bestuderen, hebben we gebruik
gemaakt van genetisch gemodificeerde muizen die de thyrostimuline subunit GPB5 niet
tot expressie brengen (GPB5-/- muizen). Wij hadden als hypothese dat de biologische
functie van thyrostimuline wellicht meer uitgesproken wordt wanneer de HPT-as onder
druk wordt gezet door experimentele interventies en we vergeleken telkens de effecten
van deze interventies in intacte, wild-type (WT) muizen en GPB5-/- muizen.
In hoofdstuk 2 hebben we de verschillen in de centrale regulatie van de HPT-as tussen
GPB5-/- en WT muizen tijdens hypothyreoïdie en thyreotoxicose bestudeerd. Omdat
177
SAMENVATTING
in eerder onderzoek was gesuggereerd dat GPB5 een functie in de ontwikkeling zou
kunnen hebben, hebben we dit experiment zowel in juveniele muizen (6 weken) als in
volwassen muizen (16 weken) uitgevoerd. Het missen van GPB5 tijdens hypothyreoïdie,
euthyreoïdie en thyrotoxicose bleek een klein effect te hebben op de sensitiviteit
van de HPT-as. Er was een disbalans tussen de serum T4- en TSH-respons die wees
op een veranderde gevoeligheid van de hypofyse voor de negatieve terugkoppeling
van schildklierhormoon. Dit fenomeen was het meest uitgesproken in de juveniele
muizen. Het enzym type 2 dejodase (D2) speelt een belangrijke rol in de negatieve
terugkoppeling door schildklierhormoon, maar de hypofysaire expressie van D2
mRNA was vergelijkbaar in GPB5-/- en WT muizen. Het exacte mechanisme van deze
veranderde gevoeligheid is op dit moment nog niet opgehelderd.
Om te onderzoeken of de hypofyse van de GPB5-/- muizen minder gevoelig is voor
thyrotropine-releasing hormoon (TRH), hebben we in hoofdstuk 3 gekeken naar de
productie en secretie van TSH en prolactine na toediening van TRH in juveniele GPB5-/en WT muizen. Serum TSH en hypofysaire TSHβ mRNA expressie stegen 20 minuten na
toediening van TRH in dezelfde mate in GPB5-/- en WT muizen, terwijl serum prolactine
en hypofysaire prolactine mRNA expressie in beide groepen niet veranderde. Wij
concludeerden dat de hypofyse van de GPB5-/- muizen niet minder gevoelig is voor TRH.
In hoofdstuk 4 hebben we de mogelijke rol van thyrostimuline in het perifeer
schildklierhormoon metabolisme bestudeerd tijdens zowel hypothyreoïdie als
thyreotoxicose in weefsels die de TSHR tot expressie brengen. Omdat activatie van de
TSHR in diverse weefsels in verband is gebracht met een stimulatie van D2, was het
verrassend dat D2 expressie juist hoger leek te zijn in weefsels van GPB5-/- muizen. Dit
pleit tegen een directe rol voor thyrostimuline – via de TSHR – in de regulatie van D2,
en suggereert eerder een inhiberende rol voor thyrostimuline of GPB5 in de regulatie
van D2. In overeenstemming met onze bevindingen in de hypofyse en hypothalamus,
konden we geen duidelijke rol voor thyrostimuline of GPB5 ontdekken in de expressie
van dejodases in wit vetweefsel, bruin vetweefsel en spier.
Tijdens ziekte verandert het schildkliermetabolisme in belangrijke mate leidend tot
het ‘nonthyroidal illness syndrome’ (NTIS), ook wel ‘laag T3 syndroom’ genoemd.
NTIS is waarschijnlijk een adaptatie van het organisme aan acute ziekte. In eerder
onderzoek werd gemeld dat proinflammatoire cytokines de transcriptie van GPB5 in
een hypofysaire cellijn induceren, hetgeen een rol voor GPB5 of thyrostimuline in NTIS
suggereert. Om dit nader te onderzoeken hebben we in hoofdstuk 5 een diermodel
gebruikt, waarin toediening van bacterieel endotoxine (lipopolysaccharide, LPS)
resulteert in een karakteristieke daling van serum T4 en T3 en van hypofysair TSHβ
mRNA. In overeenstemming met de genoemde in vitro studie, resulteerde toediening
SAMENVATTING
178
van LPS in een dramatische stijging in de expressie van GPB5 mRNA in de hypofyse en
– in mindere mate – in de hypothalamus van WT muizen. Deze inductie leidde echter
niet tot een duidelijk verschil tussen GPB5-/- en WT muizen in het LPS geïnduceerde
endocriene profiel. Onze resultaten suggereerden wel dat GPB5 betrokken is bij de LPSgeïnduceerde suppressie van TSHR mRNA in de hypofyse en hypothalamus.
Op grond van de forse centrale stimulatie van GPB5 transcriptie tijdens acute
inflammatie, onderzochten wij in hoofdstuk 6 de hypothese of hypofysair thyrostimuline
via de TSHR de perifere expressie van dejodases moduleert. Uit de diverse effecten van
GPB5 op dejodase expressie in verschillende organen konden we echter concluderen
dat de TSHR geen grote rol speelt in de GPB5 geassocieerde veranderingen in lokaal
schildklierhormoonmetabolisme. GPB5 bleek wel, net als in de hypofyse en de
hypothalamus, belangrijk te zijn voor de suppressie van de perifere TSHR expressie
tijdens NTIS. Het mechanisme achter deze GPB5-gemoduleerde TSHR-suppressie is
onduidelijk.
Hoewel opvallende verschillen tussen GPB5-/- en WT muizen aanwezig waren, hebben
we op grond van onze studies geen duidelijke en specifieke rol voor thyrostimuline
kunnen definiëren.
TSHR-stimulerende Graves’ immunoglobulinen (GD-IgG’s)
Autoimmuniteit gericht tegen de TSHR die door orbitale fibroblasten tot expressie
wordt gebracht, lijkt een belangrijke rol te spelen in de immunopathogenese van GO.
Orbitale fiboblasten lijken een rol te spelen in de zwelling van het intraorbitale weefsel
en de toename van orbitaal vet tijdens GO, doordat zij excessieve hoeveelheden
glycosaminoglycanen (GAGs) kunnen produceren en zich kunnen zich differentiëren
tot adipocyten.
Niet-gedifferentieerde orbitale fibroblasten benaderen in theorie het best de
celpopulatie die in de orbita aanwezig is in de beginfase van GO. In hoofdstuk 7
onderzochten we de rol van de TSHR en de cAMP-signaaltransductie route in nietgedifferentieerde orbitale fibroblasten verkregen na orbitale decompressie chirurgie
van patiënten met (inactieve) GO. We vonden dat sterke activatie van de cAMProute door forskoline resulteerde in een verhoogde productie van hyaluronan (HA),
terwijl de matige cAMP synthese door TSHR stimulatie (met TSH) geen effect had
op de HA-synthese in orbitale fibroblasten. Verrassend was dat TSHR-stimulerende
GD-IgG’s geen effect op cAMP productie en HA synthese hadden in deze cellen, terwijl
stimulatie met interleukine-1β (IL-1β) resulteerde in een sterke HA-inductie. Op basis
van deze in vitro observaties concludeerden we dat de orbitale cytokines waarschijnlijk
179
SAMENVATTING
verantwoordelijk zijn voor de excessieve HA productie door orbitale fibroblasten
tijdens GO.
Een subpopulatie van orbitale fibroblasten kan zich, onder andere als gevolg van
inflammatie, differentiëren tot adipocyten. Interessant is dat deze gedifferentieerde
orbitale fibroblasten de functionele TSHR verhoogd tot expressie brengen, wat
suggereert dat deze cellen een pathogenetische rol spelen in GO. In hoofdstuk 8
bestudeerden daarom de rol van de TSHR in gedifferentieerde orbitale fibroblasten.
Vergelijkbaar met onze resultaten in niet-gedifferentieerde orbitale fibroblasten,
resulteerde TSH-geïnduceerde stimulatie van de cAMP-route niet in een stijging van
HA synthese. Verrassend was dat stimulatie met TSHR-stimulerende GD-IgG’s in deze
gedifferentieerde cellen juist wel leidde tot HA-inductie, die overigens niet geassocieerd
was met een cAMP respons.
De ontwikkeling van een nanomolair potente LMW TSHR-antagonist door MSD (Oss,
Nederland) gaf ons de mogelijkheid de rol van de TSHR tijdens GO verder uit te diepen.
In hoofdstuk 9 hebben we deze LMW TSHR-antagonist in onze gedifferentieerde
orbitale fibroblastkweken getest. De TSH-, GD-IgG- en M22-geïnduceerde stijging van
de cAMP productie werd volledig geremd door relatief lage concentraties van de LMW
TSHR-antagonist, wat er op wijst dat deze cAMP-stijgingen volledig TSHR-gemedieerd
zijn. Interessant was de observatie dat stimulatie met M22 (een potent, monoklonaal
TSHR-stimulerend IgG) geen effect had op HA synthese in gedifferentieerde orbitale
fibroblasten van de onderzochte GO patient, in tegenstelling tot de heterogene batch
GD-IgG’s. Al met al suggereren onze bevindingen in dit experimentele in vitro model
dat de TSHR-gemedieerde activatie van de cAMP route geen belangrijke rol speelt in de
GD-IgG-geïnduceerde HA synthese. Dit is tegengesteld aan de heersende opvattingen.
In hoofdstuk 10 worden de bevindingen van dit proefschrift bediscussieerd in het licht
van de bestaande literatuur. De resultaten van de studies naar de rol van thyrostimuline
en de in vitro experimenten met orbitale fibroblasten worden apart besproken.