1 DNA zien?! Inleiding Alle eigenschappen van een plant, zoals de

DNA zien?!
Inleiding
Alle eigenschappen van een plant, zoals de grootte,
de vorm van het blad, en de enzymen die nodig zijn
voor de fotosynthese, liggen opgeslagen in het
DNA. Het stukje DNA dat codeert voor één van
deze eigenschappen, noemen we een gen. Een
plant bezit al snel 30 000 verschillende genen. En
het is van groot belang voor de landbouw om te
weten voor welke eigenschappen deze 30 000
genen coderen. Zo kunnen we met deze kennis
bijvoorbeeld, tomatenplanten groeien die grotere
Fig. 1- Tomaat
tomaten produceren, of maïs kweken die beter
bestand is tegen droogte.
In de Moleculaire biologie, probeert men de functie van genen/eiwitten te
achterhalen. Daarvoor worden modelsoorten gebruikt. Eén daarvan is de tomaat
(fig. 1). De eerste stap om de functies van genen te achterhalen, is het isoleren
DNA van de tomaat. Dat gaan we tijdens dit practicum doen m.b.v. de
“Edwards”- methode, een snelle methode om een grote hoeveelheid DNA uit
blad te isoleren. Grote hoeveelheden DNA kun je met het blote oog zien. Maar
kleinere hoeveelheden maken we zichtbaar op een agarose-gel. Op deze gel
kunnen we ook controleren of het DNA heel of afgebroken is.
Maar eerst…pipetteren
Moleculair
biologen
werken
met
veel
verschillende
vloeistoffen,
zoals
oplossingen van zouten, buffers en enzymen. Maar de hoeveelheden zijn
ontzettend klein. De volumes worden dan ook aangegeven in milliliters (ml;
1/1000 liter) of microliters (μl; 1/1000 000 liter). Met behulp van een pipet kunnen
deze volumes nauwkeurig worden afgemeten.
De pipet werkt als volgt:
1

Kies de pipet die bij het te pipetteren volume past.

Draai de pipet op het juiste volume.

Zet een plastic pipetpunt op de pipet (houd deze pipetpunten alleen aan het brede
deel vast, zodat reacties niet besmet worden!).

Druk de pipet met de duim in tot de “eerste weerstand”.

Zet de punt in de vloeistof en laat de duim rustig omhoog komen, zodat de vloeistof
wordt opgezogen (niet te snel!).

Pipetteer de vloeistof in een reageerbuisje door de pipet weer in te drukken tot de
“tweede weerstand”.

Vervang de plastic pipetpunt voor het pipetteren van een andere vloeistof.
Protocol DNA-Isolatie Edwards-methode
(K. Edwards et al., 1991, Nucleid Acids Research)
1-
Pak een klein stukje blad door deze “uit te ponsen”. Dit doe je door een stukje blad
tussen het epje (dit is plastic reactievaatje) en de dop te houden en de dop dicht te
drukken.
2-
Vermaal het stukje blad tot prut met behulp van een pesteltje (dit is een plastic
staafje waarmee blad wordt fijn gestampt).
3-
Voeg met de pipet 400 μl extractiebuffer toe. Deze buffer zorgt ervoor dat de
celwanden/membranen kapot gaan zodat het DNA vrijkomt. Het DNA lost vervolgens
op in de extractiebuffer.
4-
10 seconden vortexen.
5-
Centrifugeer 1 minuut bij 13 000 rpm . Door het centrifugeren komen de celresten op
de bodem te liggen. Het DNA blijft opgelost in de extractiebuffer en zit dus in de
bovenste laag.
6-
Zuig met een pipet 300 μl van de extractiebuffer (bovenste laag) voorzichtig op en
pipetteer de vloeistof in een nieuw epje. Let op dat je de celresten op de bodem laat
liggen (afval).
7-
Voeg met de pipet 300 μl isopropanol toe aan het nieuwe epje (met daarin de
bovenste laag) en meng voorzichtig door het epje een paar keer om te keren, niet
schudden! DNA lost niet op in isopropanol en zal dus gaan neerslaan.
8-
Centrifugeer 5 minuten bij 13 000 rpm. Het neergeslagen DNA komt nu op de bodem
te liggen.
9-
Zuig met de pipet de vloeisof af (afval). Let erop dat het neergeslagen DNA op de
bodem van het epje blijft liggen.
10-
Centrifugeer even kort bij 13 000 rpm en zuig het laatste restje vloeistof af (afval).
2
11-
Laat het epje 2 minuten staan met de deksel open zodat de laatste resten
isopropanol verdampen.
12-
Voeg 98 μl water + 2 μl RNAse aan het DNA toe en pipetteer een paar keer op en
neer om het DNA goed op te lossen.
Gel Electroforese
Kleine hoeveelheden DNA kunnen we op een gel zichtbaar
maken m.b.v. gel electroforese. Gel electroforese is een
1
2
scheidingstechniek die moleculen onder invloed van een
elektrisch veld laat bewegen in een gel. Negatief geladen
moleculen bewegen naar beneden waar de positieve pool zich
bevindt. DNA moleculen hebben een negatieve lading. Hoe
groter de moleculen, hoe trager ze door de gel kunnen bewegen;
hoe kleiner de moleculen, hoe sneller ze zullen bewegen. Gel
electroforese kan dus ook worden gebruikt voor het scheiden en
analyseren van DNA.
Een belangrijke analyse van het DNA is de controle of het
geïsoleerde DNA nog heel is (fig. 2), alleen dan kan het DNA
worden gebruikt voor verdere experimenten.
Fig. 2Genomisch
DNA.
1 = heel, 2 =
afgebroken.
Protocol Gel electroforese
1-
Meng 8 μl DNA met 2 μl Loading buffer. Deze buffer verzwaart het DNA, daardoor is
het makkelijker in de gel te pipetteren.
2-
Pipetteer de 10 μl in de gel.
3-
Laat de gel ongeveer 10 minuten lopen.
4-
De practicumassistent haalt de gel uit de bak en zal een foto maken.
Heb je DNA geïsoleerd? En is het DNA wat je hebt geïsoleerd nog heel of is het
afgebroken?
3