SUMMARY

SUMMARY
Pseudomonas aeruginosa is a versatile Gram-negative bacterium that can be found
in diverse environmental niches such as soils, marshes and coastal marine habitats as well
as the causative agent of infections of humans, animals and plants. During the last
century, as a recognized major opportunistic human pathogen, P. aeruginosa has received
intense interest, mainly due to its resistance to antibiotics due to the formation of drugresistant biofilms or to the emergence of phenotypic variants resistant to disinfectants that
eliminate other environmental bacteria. The release of the entire 6.3-million-base-pair of
nucleotide sequence of the genome of P. aeruginosa strain PAO1 shed for the first time
light on the relationship between genome size, genetic complexity and ecological
versatility in bacteria as well as it provided insight into its role as a pathogen. In this
study, we use P. aeruginosa strain PAO1 as a model to delineate two major issues: the
mechanism underlying the emergence of antibiotics-resistant small colony variants
(SCV), and the mode of action of the oxidative stress response regulator OxyR.
Small colony variants (SCVs) are slow-growing bacteria, which often show
increased resistance to antibiotics and cause latent or recurrent infections. It is therefore
important to understand the mechanisms at the basis of this phenotypic switch. One SCV
(termed PAO-SCV) was isolated, showing high resistance to gentamicin and to the
cephalosporine cefotaxime. PAO-SCV was prone to reversion as evidenced by
emergence of large colonies with a frequency of 10-5 on media without antibiotics
(pseudo-revertants, termed REVs) while it was stably maintained in presence of
gentamicin. PAO-SCV showed a delayed growth, defective motility, and strongly
reduced levels of the quorum sensing Pseudomonas quinolone signal (PQS). Whole
genome expression analysis further suggested a multi-layered antibiotic resistance
mechanism, including simultaneous over-expression of two drug efflux pumps (MexABOprM, MexXY-OprM), the LPS modification operon arnBCADTEF, and the PhoP-PhoQ
two-component system. Conversely, the genes for the synthesis of PQS were strongly
down-regulated in PAO-SCV. Finally, genomic analysis revealed the presence of
mutations in phoP and phoQ genes as well as in the mexZ gene encoding a repressor of
the mexXY genes. Only one mutation occurred only in the pseudo-revertant REV,
localized at nucleotide 1020 of the tufA gene, a paralog of tufB, both encoding the
elongation factor Tu, causing a change of the rarely used aspartic acid codon GAU to the
more common GAC, possibly causing an increase of tufA mRNA translation. High
expression of phoP and phoQ was confirmed for the SCV variant while the REV showed
expression levels reduced to wild-type levels. By combining data coming from
phenotypic, gene expression, and proteome analysis, we could demonstrate that
resistance to aminoglycosides in one SCV mutant is multifactorial, including the
overexpression of efflux mechanisms, LPS modification and is accompanied by a drastic
down-regulation of the Pseudomonas quinolone signal (PQS) quorum sensing system.
The LysR-type transcriptional regulator (LTTR) OxyR orchestrates the
defence of the opportunistic pathogen P. aeruginosa against reactive
oxygen species (ROS). In our previous work, we demonstrated that OxyR is
needed for the utilization of the ferrisiderophore pyoverdine, stressing
the importance of this regulator. In this work, we show that an oxyR
mutant is unable to swarm on agar plates, probably as a consequence of
absence of production of rhamnolipids surfactant molecules. Another
obvious phenotypic change was the increased production of the phenazine
redox molecule pyocyanin in the oxyR mutant. As already described, the
oxyR mutant could not grow in LB medium, unless high numbers of cells
(>108 ml-1) were inoculated. However, growth in Pseudomonas P agar
(King’s A), a medium inducing pyocyanin production was like wild type,
suggesting a protective action of this redox phenazine compound. This
was confirmed by the restoration of the capacity to grow in LB medium
upon addition of pure pyocyanin.
Next, we used comprehensive microarray analyses to determine the
OxyR regulons in diverse conditions to better understand the mechanisms
of protection via pyocyanin and the additional functions of OxyR in P.
aeruginosa. In this work, we uncovered the OxyR regulons under three
conditions (King’s A medium [Pseudomonas medium or PM], Luria Broth
(LB), and LB when oxyR is overexpressed), to investigate its roles in
different cellular aspects that are independent of the classical
oxidative stress response, in the absence of H2O2. Interestingly, when
grown in LB, OxyR was found to regulate many genes involved in the
process of inter-cellular communication known as quorum sensing (QS). In
contrast, when grown in PM, OxyR regulates the expression of a newly
identified CSS (cell-surface signaling) system in an OxyR-dependent
fashion. In addition, the results from oxyR overexpression further
confirmed that OxyR was linked to regulation of QS and Type 3 Secretion
(T3SS) in addition to the regulation of antioxidative genes. Taken
together, our results show that, apart from its dominant role in defense
against oxidative stress in P. aeruginosa, OxyR acts as a global
regulator that provides a link between the regulation of oxidative
stress response, QS and virulence.
Furthermore, we adopted a state-of-the-art technique named ChIP-chip (chromatin
immunoprecipitation in combination with whole genome tiling array analyses) to identify
the direct targets of OxyR. In P. aeruginosa, OxyR was previously described to positively
regulate the expression of the oxidative stress response genes katA, katB, ahpB, and
ahpCF. To further unravel additional targets of OxyR, we performed ChIP-chip
experiments. We detected 56 genes, including all the previously identified defensive
genes and a battery of novel direct targets of OxyR. Electrophoretic mobility shift assays
(EMSA) for selected newly identified targets indicated that ~70% of those were bound by
purified and oxidized OxyR in vitro and their regulation was further confirmed by qRTPCR. Furthermore, a thioredoxin system was identified to enzymatically reduce OxyR
under oxidative stress. Functional classification analysis showed that OxyR could control
a core regulon, composed of oxidative stress defensive genes, and a variable regulon
including genes involved in transcriptional regulation of iron homeostasis (pvdS),
quorum-sensing (rsaL), pathogenesis (pf4 prophage), transport (PA1541), protein
synthesis (rpsL), and oxidative phosphorylation (cyoA and snr1). Taken together, our
results suggest that by direct binding, OxyR fulfills its core function in oxidative stress
defense by detoxification and acts as a global regulator in diverse aspects of cellular
metabolism and development to aptly render cells more resistant to endogenous or
exogenous stresses.
SAMENVATTING
Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) is een veelzijdige gram-negatieve
bacterie die kan teruggevonden worden in diverse niches zoals de bodem, moerassen en
mariene habitatten, maar kan verder ook infecties veroorzaken bij mensen, dieren en
planten. Gedurende de laatste eeuw heeft P. aeruginosa, als een belangrijk erkende
opportunistische menselijke pathogeen, veelvuldige interesse genoten, voornamelijk
omwille van zijn resistentie tegen antibiotica, door de vorming van antibiotica-resistente
biofilms en het opduiken van fenotypische varianten die resistent zijn tegen
disinfectanten die andere omgevingsbacteriën kunnen elimineren. Het vrijgeven van de
volledige 6.3 miljoen basenparen nucleotide sequentie van het genoom van de P.
aeruginosa stam PAOI heeft voor het eerst duidelijkheid gebracht over de relatie tussen
genoomgrootte, genencomplexiteit en ecologische veelzijdigheid in bacteriën, maar
verder ook inzicht gegeven in zijn rol als pathogeen. In deze studie gebruiken we de P.
aeruginosa stam PAOI als een model om twee belangrijke onderwerpen uiteen te zetten:
het onderliggende mechanisme van het opduiken van antibiotica resistente small colony
variants (SCV’s) en het werkingsmechanisme van de oxidatieve respons regulator OxyR.
Small colony variants zijn traag-groeiende bacteriën, welke een toegenomen
resistentie aan antibiotica vertonen en latente of terugkerende infecties veroorzaken. Het
is daarom belangrijk om de mechanismen die aan de basis van deze fenotypische
omschakeling liggen, te begrijpen. Eén SCV (genaamd PAO-SCV) werd geïsoleerd en
vertoonde een verhoogde resistentie tegen gentamicine en het cephalosporine cefotaxime.
PAO-SCV was gevoelig aan reversie, hetgeen werd aangetoond door het voorkomen van
grote kolonies met een frequentie van 10-5 op media zonder antibiotica (pseudorevertanten, genaamd REVs), terwijl het fenotype behouden bleef in de aanwezigheid van
gentamicine. PAO-SCV vertoonde een vertraagde groei, een defecte motiliteit en sterk
verminderde niveaus van het quorum sensing Pseudomonas quinolone signaal PQS.
Genoom-brede genexpressiebepaling suggereerde een meergelaagd antibioticaresistentie
mechanisme, met daarbij de simultane over-expressie van twee drug efflux pompen
(MexAB-OprM, MexXY-OprM), het LPS modificatie operon arnBCADTEF, en het
PhoP-PhoQ twee-componenten systeem. Anderzijds werden de genen voor de synthese
van PQS sterk down-gereguleerd in PAO-SCV. Tenslotte, onthulde genomische analyse
de aanwezigheid van mutaties in de PhoP en PhoQ genen, net als in het mexZ gen, dat
codeert voor een repressor van de mexXY genen. Slechts één mutatie deed zich voor in de
pseudo-revertant REV, gelokaliseerd op nucleotide 1020 van het tufA gen, een paraloog
van tuf, ook coderend voor de elongatiefactor Tu, daarbij een verandering veroorzakend
van het zeldzaam gebruikte aspartaatzuur codon GAU naar het meer gebruikelijke codon
GAC, wat mogelijk zorgt voor een toename van de tufA mRNA translatie. De hoge
expressie van PhoP en PhoQ werd bevestigd voor de SCV variant, terwijl de REV
expressieniveaus vertoonde die gereduceerd waren tot wild-type niveaus. Door data
komende van fenotypische-, genexpressie- en proteoom analyse te combineren, konden
we aantonen dat resistentie tegen aminoglycosiden in één SCV mutant multifactorieel is,
waarbij de overexpressie van efflux mechanismen, LPS modificatie en een drastische
down-regulatie van het Pseudomonas quinolone signaal quorum sensing (PQS) systeem
een rol spelen.
De LysR-type transcriptionele regulator (LTTR) OxyR orkestreert de verdediging
van de opportunistische pathogeen P. aeruginosa tegen reactieve zuurstofverbindingen
(reactive oxygen species, ROS). In ons eerder werk hebben we aangetoond dat OxyR
noodzakelijk is voor het gebruik van het ferrisiderofoor pyoverdine, hetgeen het belang
van deze regulator benadrukt. In dit werk tonen we aan dat een oxyR mutant niet kan
doen aan swarming op agarplaten, mogelijk als gevolg van de afwezigheid van de
productie van rhamnolipide surfactant moleculen. Een andere duidelijke fenotypische
verandering was de toegenomen productie van het phenazine redoxmolecule pyocyanine
door de oxyR mutant. Zoals reeds beschreven, was de oxyR mutant niet in staat om te
groeien in LB medium, tenzij hoge aantallen cellen (>108 ml-1) geïnoculeerd werden. In
tegenstelling tot dit, was de groei van deze mutant in Pseudomonas P agar (King’s A), een
medium dat pyocyanine productie stimuleert, vergelijkbaar met deze van het wild-type,
wat mogelijk wijst op een beschermende actie van dit redox phenazine bestanddeel. Dit
werd bevestigd door het herstellen van de capaciteit om in LB medium te groeien na de
toevoeging van puur pyocyanine.
Vervolgens gebruikten we uitvoerige microarray analyses om de OxyR regulons
in diverse condities te bepalen zodat een beter beeld van de beschermingsmechanismen
via pyocyanine en de additionele functies van OxyR in P. aeruginosa kan verkregen
worden. In dit werk, onthulden we de OxyR regulons onder drie condities (King’s A
medium [Pseudomonas medium of PM], Luria Broth (LB) en LB, wanneer oxyR tot
overexpressie is gebracht), om hun rollen te onderzoeken in verschillende cellulaire
aspecten die onafhankelijk zijn van de klassieke oxidatieve stress respons, d.w.z. in
afwezigheid van H2O2. Een interessante bevinding is dat wanneer opgegroeid in LB,
OxyR meerdere genen die betrokken zijn in het proces van intercellulaire communicatie,
beter gekend als quorum sensing (QS), opreguleert. In tegenstelling tot dit, reguleert
OxyR de expressie van een nieuw geïdentificeerd cel oppervlakte signalisatie systeem
(cell-surface signaling, CSS) op een OxyR-afhankelijke manier. Bovendien bevestigden
de resultaten van de oxyR overexpressie dat OxyR gelinkt was aan de regulatie van QS en
Type 3 Secretie (T3SS) naast de regulatie van anti-oxidatieve genen. Samengevat, tonen
onze resultaten dat, verschillend van zijn dominante rol in de verdediging tegen
oxidatieve stress in P. aeruginosa, OxyR ageert als een globale regulator die een link
vormt tussen de regulatie van de oxidatieve stress respons, QS en virulentie.
Verder, pasten we een state-of-the-art techniek, genaamd ChIP-chip (chromatine
immunoprecipitatie) toe, in combinatie met genoom-brede tiling array analyses, om de
onmiddelijke doelwitten van OxyR te identificeren. Eerder werd beschreven dat in P.
aeruginosa, OxyR de expressie van de oxidatieve stress respons genen katA, katB, ahpB
en ahpCF positief reguleert. Om bijkomende doelwitten van OxyR te ontdekken, voerden
we ChIP-chip experimenten uit. We detecteerden 56 genen, waaronder alle voorheen
geïdentificeerde verdedigingsgenen en een batterij aan nieuwe onmiddellijke doelwitten
van OxyR. Electrophoretic mobility shift assays (EMSA), die werden gebruikt voor de
geselecteerde nieuw geïdentificeerde doelwitten, gaven aan dat ~70% van deze
doelwitgenen werden gebonden door gezuiverd en geoxideerd OxyR in vitro en hun
regulatie werd verder bevestigd via qRT-PCR. Verder bleek een thioredoxine systeem
OxyR enzymatisch te reduceren onder oxidatieve stress. Functionele classificatie analyse
toonde aan dat OxyR een kernregulon zou kunnen controleren, bestaande uit oxidatieve
stress verdedigingsgenen en een variabel regulon dat deze genen bevat die betrokken zijn
in de transcriptionele regulatie van ijzer homeostase (pvdS), quorum-sensing (rsaL),
pathogenese (pf4 profaag), transport (PA1541), eiwitsynthese (rpsL) en oxidatieve
fosforylatie (cyoA and snr1). Samengevat, suggereren onze resultaten dat OxyR door
directe binding zijn kernfunctie in oxidatieve stressverdediging vervult via detoxificatie
en ageert als een globale regulator in verscheidene aspecten van cellulair metabolisme en
ontwikkeling om vervolgens cellen meer resistent te maken aan endogene en exogene
stressen.