Analyse van DNA-adducten van nitrosylatieproducten in de Caco

UNIVERSITEIT GENT
FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN
Vakgroep Veterinaire Volksgezondheid en Voedselveiligheid
Laboratorium Chemische Analyse
Academiejaar 2009-2010
Analyse van DNA-adducten van
nitrosylatieproducten in de Caco-2
cellijn
Heleen MYLLE
Eerste Master in de Farmaceutische Zorg
Promotor
Dr. Ir. L. Vanhaecke
Commissarissen
Prof. S. De Saeger
Dr. J. Diana Di Mavungu
AUTEURSRECHT
“De auteur en de promotor geven de toelating deze masterproef voor consultatie beschikbaar te
stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de
beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk
de bron te vermelden bij het aanhalen van de resultaten uit deze masterproef.”
21 mei 2010
Promotor
Dr. Ir. L. Vanhaecke
Auteur
Heleen Mylle
Woord vooraf
In dit voorwoord zou ik graag een aantal mensen willen bedanken zonder wie ik deze thesis nooit
tot een goed eind had kunnen brengen. Allereerst zou ik graag mijn promotor Lynn Vanhaecke
willen bedanken voor de goede begeleiding en het ter beschikking stellen van materiaal voor het
schrijven van deze thesis. Ook wil ik Mieke Naessens, Dirk Stock en Lucie Dossche bedanken voor
hun goede begeleiding en kennisoverdracht. Ik kon telkens met mijn vragen bij hen terecht en
dankzij hun kritisch oog op mijn werk werd ik gestimuleerd om deze thesis tot een goed einde te
brengen. Voor mijn onderzoek kon ik ook rekenen op de steun van Kim Van Deun. Ik zou haar graag
bedanken voor haar tijd en hulp bij mijn celkweek..
Graag zou ik mijn kotgenoten Julie Van Den Broucke en Nikita Stevens willen bedanken om mij bij
te staan tijdens het schrijven van mijn thesis. En als laatste mijn ouders omdat zij altijd in mij zijn
blijven geloven en mij de kans hebben gegeven om farmacie te studeren.
INHOUDSOPGAVE
DEEL I. INLEIDING
1
VLEES EN KANKER .............................................................................................. 1
2
N-NITROSOVERBINDINGEN .............................................................................. 2
3
2.1
CHEMIE .............................................................................................................. 2
2.2
VOORKOMEN ................................................................................................... 4
2.3
VORMING .......................................................................................................... 4
2.4
METABOLISME ................................................................................................ 7
2.5
BIOLOGISCHE ACTIVITEIT ........................................................................... 8
N-NITROSOVERBINDINGEN EN DNA-ADDUCTEN………………………..10
3.1
DEFINITIE ..................................................................................................... ...10
3.2
BELANGRIJKE ENDOGENE N-NOC'S EN DNA-ADDUCTVORMING ... 11
3.3
DETECTIE VAN N-NOC DNA-ADDUCTEN................................................ 12
DEEL II. OBJECTIEVEN…………………………………………….……...16
DEEL III. MATERIAAL EN METHODEN………………….……………..17
1. CACO-2 CELLIJNEN……………………………………………………………...17
1.1 ALGEMENE HANDELINGEN ....................................................................... 17
2
3
1.2
TRYPAN BLUE................................................................................................ 17
1.3
DNA EXTRACTIE EN OPZUIVERING ......................................................... 19
1.4
NANODROPMETHODE ................................................................................. 21
UHPLC-MS/MS ANALYSE ................................................................................. 21
2.1
UHPLC ANALYSE .......................................................................................... 21
2.2
MASSASPECTROMETRIE ............................................................................. 23
ANALYSE VAN DNA-ADDUCTEN ................................................................... 24
3.1
REFERENTIE MATRIX (KALFTHYMUS DNA).......................................... 24
3.2
BEHANDELING VAN KALFTHYMUS DNA MET N-NOC'S ..................... 26
3.3
BEHANDELING VAN CACO-2 CELLEN MET N-NOC'S ........................... 27
DEEL IV. RESULTATEN……………………………………………………29
1
OPTIMALISATIE VAN DNA-ADDUCT EXTRACTIE EN OPZUIVERING ..
……………………………………………………………………………………...29
2
OPTIMALISATIE VAN DE UHPLC METHODE ............................................ 30
3
OPTIMALISATIE VAN DE MS/MS DETECTIE ............................................. 32
3.1
KWANTIFICATIE VAN O6-METHYLGUANINE ........................................ 33
4
ADDUCTVORMING DOOR N-NOC'S IN KALFTHYMUS DNA ................. 34
5
ADDUCTVORMING DOOR N-NOC'S IN CACO-2 CELLEN ....................... 35
DEEL V. DISCUSSIE…………………………………………………….…...38
1
INLEIDING ............................................................................................................ 38
2
OPTIMALISATIE VAN DE UHPLC-MS/MS METHODE.............................. 38
3
ADDUCTVORMING DOOR N-NOC'S IN DNA ............................................... 39
3.2
ADDUCTVORMING DOOR N-NITROSOVERBINDINGEN IN KALFTHYMUS DNA ................................................................................................ 39
3.3
ADDUCTVORMING DOOR N-NITROSOVERBINDINGEN IN CACO-2
CELLEN ............................................................................................................ 39
DEEL VI. CONCLUSIE………………………………………………………42
DEEL VII. LITERATUURLIJST…………………………………………….43
LIJST MET AFKORTINGEN
AGT
O6-alkylguanine DNA alkyltransferase
AMS
Accelerator mass spectrometry
ATCC
American Type Culture Collection
AS
Azaserine
CTAB
Hexadexyltrimethyl ammonium bromide
DMEM
Dulbecco‟s modified Eagle‟s medium
DNA
Deoxyribose nucleïnezuur
GC
Gaschromatografie
HCA‟s
Heterocyclische amines
IARC
International Agency for Research on Cancer
KDA
Kaliumdiazoacetaat
LAF
Laminar air flow
MNNG
N-methyl-N‟-nitro-N-nitrosoguanidine
MNU
N-methyl-N-nitrosurea
MS
Massaspectrometrie
NDEA
N-nitrosodiethylamine
NDMA
N-nitrosodimethylamine
NH4OAc
Ammoniumacetaat
N-NOC‟s
N-nitrosoverbindingen
NPIP
N-nitrosopiperidine
NPYR
N-nitrosopyrrolidine
6
O -CM-dG
O6-carboxymethyldeoxyguanosine
O6-Me-dG
O6-methyldeoxyguanosine
O6-MeG
O6-methylguanine
O6-CMeG
O6-carboxymethylguanine
PAK‟s
Polycyclische aromatische koolwaterstoffen
UHPLC
Ultra hoge druk vloeistof chromatografie
7-CMG
7-carboxymethylguanine
DEEL I. INLEIDING
1. VLEES EN KANKER
Vlees is rijk aan Vitamine B6 en B12, niacine, zink, riboflavine, ijzer, panthoteenzuur,
selenium, ω3-vetzuren en aminozuren. Vlees is dus een bron aan essentiële vetzuren, vitamines en
precursoren van talrijke vereiste componenten. Rauw rood vlees bevat ongeveer 20-25 g eiwit per
100 g. Gekookt rood vlees bevat 28-36 g per 100 g, omdat de hoeveelheid water daalt en de
hoeveelheid nutriënten meer geconcentreerd wordt gedurende het koken. Eiwitten in vlees
verschaffen alle essentiële aminozuren (lysine, threonine, methionine, fenylalanine, tryptofaan,
leucine, isoleucine en valine). Het aminozuur glutamine is in de hoogste concentratie (16,5%)
aanwezig in vlees, gevolgd door arginine, alanine en asparaginezuur (Williams, 2007). Vlees bevat
eveneens een endogene anti-oxidatieve rol en andere bioactieve substanties zoals taurine (110
mg/100 g in lamsvlees en 77 mg/100 g in rundsvlees), glutathion, creatine en choline. Choline is
een precursor van een aantal essentiële componenten, inclusief neurotransmitters en
membraanfosfolipiden. Hoewel choline in het lichaam kan aangemaakt worden, is het essentieel in
de voeding. Glutathion is een component van de glutathionperoxidase enzymes, welke een
belangrijke anti-oxidatieve rol in het lichaam hebben. Ze kunnen ook een rol spelen in de
immuunrespons en verbetering van de ijzerabsorptie. Creatine en zijn gefosforyleerd derivaat,
creatinefosfaat, spelen een belangrijke rol in het energiemetabolisme van de spier. Verwerkt vlees
zoals salami, is een product, minder dan 30% vlees bevattend, dat een methode van bewerking heeft
ondergaan anders dan invriezen, inclusief behandeld en/of gedroogd vlees. Andere voorbeelden van
verwerkt vlees zijn hot dogs, salami en ham (Williams, 2007).
Het eten van vlees heeft echter niet alleen voordelen. Er bestaat namelijk een associatie tussen
de consumptie van vlees en een verhoogd risico op kanker. Deze associatie is vooral geldig voor
colon- en rectumkanker en geldt in het bijzonder voor rood vlees en verwerkte vleesproducten. Dit
kan verklaard worden door het hoog gehalte aan vet aanwezig in vlees. Een andere hypothese is de
vorming van heterocyclische amines (HCA‟s) en polycyclische aromatische koolwaterstoffen
(PAK‟s) tijdens het bakken, braden en koken van vlees. HCA‟s worden gevormd bij hoge
temperatuur door reactie van creatine en aminozuren (Ferguson et al., 2010). HCA‟s zijn echter
even sterk aanwezig in goed doorbakken kippevlees als in gebakken of gebraden rood vlees maar de
consumptie van wit vlees wordt niet geassocieerd met het risico op kanker (Demeyer et al., 2008).
PAK‟s worden op hun beurt geproduceerd bij het grillen van vlees op een directe vlam. Deze
PAK‟s hechten zich vast op het oppervlak van het voedsel en hoe meer intens het vuur is, hoe meer
1
PAK‟s geproduceerd worden. Ook dit vindt eveneens plaats bij wit vlees (kip,…), waar een
duidelijke associatie met het risico op kanker ontbreekt. Een derde mogelijke verklaring voor de
associatie tussen vlees en kanker is de vorming van N-nitrosoverbindingen. Uit verschillende
studies werd aangetoond dat de concentratie aan nitrosocomponenten stijgt door het consumeren
van rood vlees en verwerkte vleesproducten (Bingham et al., 2002). Rood vlees is een bron van
haem dat de vorming van N-nitrosoverbindingen bevordert. Haem is een verbinding die
gemakkelijk genitrosyleerd wordt tot ijzer-nitrosyl-haem en zo de nitrosylatie in het lichaam zal
bevorderen. N-nitrosoverbindingen bevorderen op hun beurt de alkylatie van DNA, wat aan de
oorsprong van dit kankerverwekkend effect kan liggen (Bingham et al., 2009).
2. N-NITROSOVERBINDINGEN
2.1 CHEMIE
N-nitrosoverbindingen kunnen ingedeeld worden op basis van hun chemische structuur.
Men maakt een onderscheid tussen nitrosamines, nitrosamides en nitrosoguanidines (Bingham et
al., 2007). De basisstructuur van N-nitrosoverbindingen wordt voorgesteld in figuur 1.1.
FIGUUR 1.1 BASISSTRUCTUUR VAN N-NITROSOVERBINDINGEN (WHO, 1978)
Nitrosamines, die gevormd worden als nitraat en amines samen worden toegediend, zijn over
het algemeen stabiele componenten die slechts traag ontbinden onder invloed van het licht of in
zure oplossingen (WHO, 1978). Enkele voorbeelden zijn N-nitrosodimethylamine (NDMA), Nnitrosodiethylamine (NDEA), N-nitrosopiperidine (NPIP) en N-nitrosopyrrolidine (NPYR) (Hebels
et al., 2009) (Figuur 1.2). In tegenstelling hiermee, zijn nitrosamides veel minder stabiel in zure
oplossingen en onstabiel in basische oplossingen (WHO, 1978). Twee voorbeelden van
nitrosamides zijn N-methyl-N-nitrosurea (MNU) en N-methyl-N‟-nitro-N-nitrosoguanidine
(MNNG) (Tabel 1.1).
2
FIGUUR 1.2 VEEL VOORKOMENDE NITROSAMINES
TABEL 1.1 LIJST VAN VEEL VOORKOMENDE N-NITROSOVERBINDINGEN EN HUN
AFKORTINGEN (Stuff et al., 2009)
Component
Afkorting
N-nitrosodimethylamine
NDMA
N-nitrosodiethylamine
NDEA
N-nitrosopiperidine
NPIP
N-nitrosopyrrolidine
NPYR
N-nitrosarcosine
NSAR
N-nitrosoproline
NPRO
N-nitrosotioazolidine-4-carboxylic acid
NTCA
N-nitroso-2-hydroxymethylthiazolidine-4-carboxylic acid
NHMTCA
N-nitrosodibutylamine
NDBA
N-nitrosodipropylamine
NDPA
N-nitrosomorpholine
NMOR
N-nitrosothiazolidine
NTHZ
N-methyl-N-nitrosurea
MNU
N-methyl-N‟-nitro-N-nitrosoguanidine
MNNG
De fysische eigenschappen van N-nitrosocomponenten variëren afhankelijk van de
substituenten. Sommige zijn olie-achtige vloeistoffen. Andere zijn oplossingen, die weinig
oplosbaar zijn in ethanol en onoplosbaar in water. Nitrosamines vertonen UV absorptie in water bij
230-240 nm en 330-350 nm. Voor nitrosamides is dit bij 390-420 nm (WHO, 1978). Er bestaat een
lineaire relatie tussen de hoeveelheid nitrosamine gevormd en de pKa waarde van het amine
(Bartsch et al., 1992).
3
2.2 VOORKOMEN
N-nitrosoverbindingen zijn aanwezig in verschillende types voedsel zoals bier, vis en met
nitriet bewerkt vlees (Tabel 1.2). Ze worden ook in lage concentraties (1-40 µg/m³) teruggevonden
in de lucht als resultaat van luchtvervuiling. In tabaksrook zijn de nitrosamines belangrijk
aanwezige componenten. Ze kunnen ook ontstaan uit de in tabak aanwezige nicotine, nornicotine en
anatibe (De Bont & Van Larebeke, 2003).
TABEL 1.2 CONCENTRATIES N-NITROSOVERBINDINGEN (µg/100g) IN BEPAALDE
VOEDINGSMIDDELEN (Stuff et al., 2009)
NDMA
NPYR
NPIP
Volle melk
0.014
0.003
0.003
Margarine
0.026
Frieten
0.024
0.041
Witte wijn
0.025
0.109
Boter
0.026
Bier
0.202
Ham
0.490
Hot dogs
0.221
NDEA
NDBA
NMOR
NPRO
NTCA
NTHZ
5.752
46.130
0.154
8.950
0.372
0.049
0.049
0.534
0.004
0.149
0.458
0.286
2.3 VORMING
N-nitrosoverbindingen (N-NOC‟s) worden gevormd door de reactie van nitriet met
verbindingen rijk aan amine, amide of andere groepen welke nitroseerbaar zijn in deze reactie.
Mensen worden blootgesteld aan nitriet door opname van nitraat bevattend voedsel (Krul et al.,
2003). Er wordt geschat dat voor volwassenen 25% van het ingeslikte nitraat kan worden
teruggevonden in het speeksel na de absorptie ervan ter hoogte van de bovenste dunne darm en het
transport ervan naar het plasma. Nitriet aanwezig in de mond, is afkomstig van 20% van dit
ingeslikte nitraat dus wordt er 5% van het nitraat, opgenomen via het voedsel, teruggevonden als
nitriet in het speeksel (De Bont & Van Larebeke, 2003).
Nitriet is aanwezig in de maag waarbij 80% afkomstig is van speeksel en 20% opgenomen
wordt via het voedsel (Brambilla & Martelli, 2006), maar kan ook endogeen gevormd worden
(Figuur 1.3). De endogene vorming begint met de oxidatie van het aminozuur L-arginine in
ongeveer alle lichaamscellen. L-arginine wordt omgezet tot L-citrulline waarbij stikstofmonoxide
(NO) wordt vrijgesteld. NO zal aanleiding geven tot nitraat en nitriet. Deze reactie wordt
gekatalyseerd door NO-synthase (Krul et al., 2003).
4
De endogene vorming van N-nitrosoverbindingen gebeurt op zijn beurt door twee
mechanismen, nl. chemisch en microbieel. De eerste reactie is een directe chemische reactie tussen
secundaire aminocomponenten en nitriet. Deze reactie is pH afhankelijk en gebeurt zeer traag bij
neutrale pH, zelfs in de aanwezigheid van chemische katalysatoren.
FIGUUR 1.3 DE CIRCULATIE VAN NITRAAT EN NITRIET IN HET MENSELIJK LICHAAM
(Lundberg et al., 2004)
Een tweede mogelijk reactie is een directe bacteriële katalyse van de N-nitrosatie, welke veel
sneller gebeurt bij neutrale pH dan de directe chemische reactie (Brambilla & Martelli, 2006). De
endogene vorming van N-nitrosoverbindingen gebeurt op verschillende plaatsen in het lichaam: in
de mondholte en de maag, in de longen en kan gebeuren in geïnfecteerde of ontstoken organen
zoals de urineblaas gemediëerd door bacteriën en macrofagen (De Bont & Van Larebeke, 2003). De
endogene vorming van NOC‟s in de maag is complex omdat het beïnvloed wordt door variërende
fysiologische parameters, inclusief de pH in de maag, de aanwezigheid van bacteriën en antioxidanten (Michaud et al., 2009).
De nitrosatie gebeurt door de omzetting van nitriet tot HNO2, waarna dit omgezet wordt tot
nitriet anhydride (N2O3). De snelheid van nitrosatie is afhankelijk van de concentratie amine en
5
nitrietanhydride. Thiocyanaat, aanwezig in het speeksel en maagsap, zorgt voor katalyse van de
nitrosatie door vorming van de nitroserende species ON-NCS. Thiocyanaat doet de snelheid van
nitrosatie van amines stijgen, maar niet de vorming van nitrosamides (Figuur 1.4). Ook bromide en
chloride hebben een katalyserend effect door de vorming van NOBr en NOCl (Brambilla &
Martelli, 2006).
N-nitrosoverbindingen kunnen ontstaan uit verschillende precursoren. Enerzijds heb je de
aminozuren, anderzijds N-nitrosothiolen. Bij de aminozuren is vooral glycine belangrijk. Er treedt
een nitrosatie op tot diazoacetaat. Ook nitrosothiolen kunnen aanleiding geven tot diazoacetaat.
Nitrosothiolen, die snel gevormd worden uit nitriet en thiolgroepen bij de heersende lage pH in de
maag, kunnen zich ook gedragen als precursoren voor de endogene vorming van nitrosylhaem en
andere nitrosoverbindingen in de dunne en de dikke darm. Deze verbindingen worden minder
stabiel bij overgang naar de darm, waar een hogere pH heerst. Bij mensen met een hoge consumptie
aan vlees werd een hogere concentratie nitrosothiolen en nitrosylijzer vastgesteld in vergelijking
met mensen met een lagere consumptie (Bingham et al., 2007).
FIGUUR
1.4
ACIDIFICATIE
VAN
NITRIET
KAN
LEIDEN
TOT
MEERDERE
NITROSATIE/NITROSYLATIE PRODUCTEN WELKE VERSCHILLENDE GEVOLGEN
KUNNEN HEBBEN OP DE GASTRO-INTESTINALE TRACTUS. IJZER KAN NITROSYL
SPECIES (Fe2+NO) VORMEN, THIOLEN KUNNEN OMGEZET WORDEN TOT SNITROSOTHIOLEN (RSNO), EN AMINES TOT N-NITROSOAMINES (R2N-NO) (Hogg, 2007).
6
De concentratie nitrosylijzer was significant hoger dan deze van nitrosothiol, wat de rol van
de haemgroep aantoont in de vorming van N-nitrosoverbindingen (Bingham et al., 2007).
2.4 METABOLISME
N-nitrosoverbindingen worden snel geabsorbeerd uit de gastro-intestinale tractus. Een deel
van deze verbindingen wordt onveranderd uitgescheiden via de nier, maar het grootste deel wordt
metabolisch getransformeerd. Verschillende metabolieten van N-nitroso componenten werden reeds
teruggevonden in de urine (De Bont & Van Larebeke, 2003).
FIGUUR 1.5 METABOLISME VAN NDMA (Rostkowska et al., 1998)
N-nitrosamines vereisen metabolische activatie door α-hydroxylaties door Cytochroom P450
tot α-hydroxynitrosamines om een carcinogeen effect uit te oefenen. Deze activatie komt het meest
voor in organen, waaronder de lever, waar tumoren zich ontwikkelen. Een nitrosamine waarvan het
metabolisme goed gekend is, is N-nitrosodimethylamine (NDMA) (Dietrich et al., 2005). N-
7
nitrosodimethylamine (NDMA) wordt zoals de meeste exogene componenten hoofdzakelijk
gemetaboliseerd door de lever, waardoor de lever het belangrijkste orgaan is van de eveneens
NDMA-geïnduceerde carcinogenese (Figuur 1.5). NDMA wordt gemetaboliseerd door een CYP450
enzym tot methyldiazonium hydroxide, welke een SN1 methylerende component is. Een SN1 reactie
is een nucleofiele alifatische substitutiereactie. Hierbij wordt de leaving groep, een deel van de
substraatmolecule, vervangen door een nucleofiel deeltje. Dit metaboliet is kort-levend, waardoor
de grootste schade zal aangericht worden op de plaats van metabolisatie, nl. de lever (Kryptopoulos
et al., 1996). In de biotransformatie zijn er twee belangrijke groepen enzymen welke carcinogenen
metaboliseren, nl fase I enzymen, waaronder de CYP450 enzymen, en fase II enzymen, waaronder
glutathion S-transferase (GST), N-acetyltransferase (NAT) en sulfotransferases (SULF). De fase I
enzymen zetten hydrofobe componenten om tot meer wateroplosbare verbindingen via oxidatie,
hydroxylatie en reductie. De fase II enzymen katalyseren vooral conjugatiereacties (Böhmer et al.,
2005).
De blootstelling aan nitrosamines wordt eveneens gerelateerd met een verhoogde vorming van
radicalen. Nitrosamines kunnen NO· vrijstellen onder bepaalde condities en formaldehyde
genereren gedurende het metabolisme, wat uiteindelijk zal leiden tot deaminatie en vorming van het
hydroxymethyladduct (Hebels et al., 2009).
N-nitrosamides worden omgezet tot gelijkaardige alkylerende verbindingen door chemische
niet-enzymatische reacties (Mirvish et al., 1995).
2.5 BIOLOGISCHE ACTIVITEIT
De meeste N-nitrosoverbindingen zijn gekende carcinogene verbindingen die bijdragen tot het
risico op de ontwikkeling van kanker bij de mens. Van de meeste N-NOC‟s worden genotoxische
effecten beschreven waardoor DNA adducten gevormd worden. Vier NOC‟s, N-nitrosamines
waaronder N-nitroso-dimethylamine, werden geklasseerd door de International Agency for
Research on Cancer (IARC) als waarschijnlijk genotoxisch en 15 andere, waaronder Nnitrosodiethanolamine, als mogelijk genotoxisch ten opzichte van de mens (Brambilla & Martelli,
2006) (Tabel 1.3). De gastro-intestinale tractus is het eerste doel van de endogeen gevormde NNOC‟s en het colon is een belangrijke plaats van endogene nitrosylatie. Daarom zijn modificaties
van de coloncellen relevant na blootstelling aan NOC‟s (Hebels et al., 2009). Er werd een associatie
vastgesteld tussen de blootstelling aan NOC‟s en een gestegen risico op gastrale-, blaas- en
colonkankers (Krul et al., 2003). Nitrosamines induceren hoofdzakelijk tumoren in de lever,
8
oesophagus, nasale en orale mucosa, de nieren, de pancreas, de blaas, de longen en de schildklier,
terwijl nitrosamides voornamelijk tumoren induceren in het lymfestelsel en het zenuwstelsel en bij
orale inname in de maag en het duodenum (Mirvish et al., 1995).
Zoals reeds eerder aangehaald, is een stijgende consumptie van rood vlees gerelateerd aan een
verhoogde vorming van DNA adducten. De betrokkenheid van deze DNA adducten in de
ontwikkeling van kanker, kan toegeschreven worden aan de inductie van mutaties in het kanker
gerelateerde gen, p53. P53 is een gen waarin frequent mutaties ontstaan, vnl. in de codons 158, 245
en 248. In codon 245 en 248 wordt de AGT herstelling geïnhibeerd door de aanwezigheid van
cytosine methylaties. In codon 158 wordt de AGT herstelling vergemakkelijkt (Guza et al., 2009).
TABEL 1.3 CARCINOGENE NITROSOVERBINDINGEN (Brambilla & Martelli, 2006)
Waarschijnlijk carcinogeen
Mogelijk carcinogeen
N-nitrosodimethylamine
N-nitrosodi-n-butylamine
N-nitrosodiethylamine
N-nitrosodiethylethanolamine
N-methyl-N-nitrosurea
N-nitrosodiethylamine
N-ethyl-N-nitrosurea
N-nitrosodimethylamine
N-nitrosodi-n-propylamine
N-nitroson-n-methylurea
N-nitrosomethylvinylamine
N-nitrosomorpholine
N-nitrosonornicotine
N-nitrosopiperidine
N-nitroso-pyrrolidine
N-nitrososarcosine
N-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridil)1-butanone
N-methylnitrosaminopropionitriel
N-methyl-N‟-nitro-N-nitrosoguanine
N-nitrosoureathaan
Streptozotocine
Verschillende in vivo studies werden reeds uitgevoerd om het werkingsmechanisme van de Nnitroso verbindingen te achterhalen. Hiervoor wordt gebruik gemaakt van grote dosissen, welke
resulteren in de vernietiging van O6-alkylguanine DNA alkyltransferase (AGT). Dit enzym is
verantwoordelijk voor de herstelling van het adduct O6-alkylguanine. Door de vernietiging van dit
enzym zullen O6-alkylguanine adducten accumuleren. Dit DNA-adduct is verantwoordelijk voor
een GCAT transitie, omdat O6-alkylguanine eerder paart met thymine dan met cytosine.
9
Daardoor ging men anticiperen dat deze mutaties verwacht werden in N-NOC geïnduceerde
tumoren (Mirvish., 1995). O6-alkylguanine DNA alkyltransferase beschermt het genoom tegen
GA transitiemutaties door de alkylgroep op de O6 positie van de gemodificeerde guaninebase te
verwijderen. Dit gebeurt in verschillende stappen: in de eerste stap zal AGT binden aan het DNA
adduct waardoor het gealkyleerde nucleotide uit het DNA wordt gehaald en zal binden aan AGT
(Figuur 1.6). Het gealkyleerde AGT proteine dissocieert daarna van het herstelde DNA (Guza et al.,
2009). De AGT gemedieerde herstelling wordt beïnvloed door cytosine methylatie. Door deze
methylatie zal de AGT gemedieerde herstelling vertraagd gebeuren omdat de stabiliteit en baseopeenhoping stijgt en de waterstofbindingen worden versterkt waardoor de „minor groove‟ zal
vernauwen. Hierdoor zal de verwijdering van het nucleotide vertraagd gebeuren want AGT bindt
het DNA in de „minor groove‟. Ook de snelheid van herstelling zal veel trager zijn in enkelstrengig
DNA in vergelijking met dubbelstrengig DNA. Dit zal leiden tot adductaccumulatie en een hogere
mutagenese (Guza et al., 2009).
FIGUUR 1.6 HERSTELLING O6-ALKYLGUANINE-ADDUCT DOOR AGT (Guza et al., 2009)
3 N-NITROSOVERBINDINGEN EN DNA-ADDUCTEN
3.1 DEFINITIE
Een DNA-adduct is de covalente binding van een chemische component aan DNA, en deze
adductvorming kan specifiek zijn of andere addities of modificaties inhouden zoals oxidatie,
deaminatie of methylatie (Shuker et al., 2009). N-nitrosoverbindingen kunnen DNA-adducten
produceren door
uiteen te vallen of gemetaboliseerd te worden via α-hydroxylatie tot sterk
reactieve methylerende componenten, zoals het diazoniumion, dat reageert met nucleofiele centra
op DNA basen (Hebels et al., 2009).
10
FIGUUR 1.7 STRUCTUUR VAN ENKELE VEEL VOORKOMENDE DNA ADDUCTEN
Het gevolg van deze reactie is een alkylatie op de N7 en O6 positie van guanine en de O4
positie
van
thymine
transitiemutaties,
(Figuur
1.7).
O6-alkylguanine-adducten
O4-alkylthymine-adducten
veroorzaken
TAGC
veroorzaken
transities,
GCAT
voor
N7-
alkylguanine-adducten werd tot op heden niet aangetoond dat ze mutageen zijn (Hebels et al.,
2009).
3.2 BELANGRIJKE ENDOGENE N-NOC‟S EN DNA-ADDUCTVORMING
O6-carboxymethyldeoxyguanosine (O6-CMe-dG) en O6-methyldeoxyguanosine (O6-Me-dG)
kunnen gevormd worden uit genitrosyleerde glycine derivaten zoals kaliumdiazoacetaat (KDA) en
azaserine (AS) en het nitrosamide N-methyl-N-nitrosurea (MNU) (Terasaki et al., 2008) (Figuur
1.8). Glycine is het meest voorkomende voedingsaminozuur, waardoor de nitrosatieproducten een
belangrijke bron vormen van alkylerende middelen in de GI tractus (Terasaki et al., 2008). DNA
behandeld met azaserine en KDA bood O6-CMe-dG aan in een hoeveelheid van 7,3 en 496 µmol
O6-CMe-dG per mol dG. Ze worden beschouwd als leden van een familie van nitroserende
glycinederivaten welke aanleiding geven tot carboxymethylerende verbindingen met als resultaat de
vorming van O6-CMe-dG maar ook DNA methylatie (Shuker et al., 1997).
KDA is een carcinogene stof, waarvan zijn activiteit werd aangetoond door behandeling van
een plasmine, welke een humane cDNA sequentie van p53 bevat, met KDA. Als resultaat hiervan
ontstonden verschillende mutaties. De mutaties geïnduceerd door KDA werden hoofdzakelijk
veroorzaakt door O6-CMe-dG adducten. De geobserveerde mutaties in kanker bij mensen matchen
het best met deze geïnduceerd door KDA. Een aantal mutaties geïnduceerd door KDA, komen niet
voor bij de mens omdat er tijdens de groei van de tumor ook een selectie gebeurt (Shuker et al.,
11
2007). N-methyl-N-nitrosurea (MNU) is een sterk mutageen en genotoxisch nitrosamide. Zijn
mutagene en genotoxische activiteit wordt gerelateerd aan de mogelijkheid om O6-alkylguanosine
te vormen (Demopoulos et al., 1996). Hierdoor zullen ook mutaties ontstaan in het DNA. In
tegenstelling tot KDA worden deze geïnduceerd door O6-Me-dG (Shuker et al., 2007). Azaserine is
een pancreatisch carcinogeen waarvan eveneens verwacht werd DNA-adducten te vormen. De
meest waarschijnlijke DNA-adducten die gevormd worden bij onderzoek van DNA, behandeld met
azaserine en voorafgaandelijk gehydrolyseerd onder neutrale condities, zijn N-gealkyleerde purines.
De resultaten suggereren dat het azaserinemetabolisme resulteert in carboxymethylatie van DNA.
Om dit aan te tonen werd 7-carboxymethylguanine (7-CMeG) gesynthetiseerd. Dit is het meest
waarschijnlijke DNA-adduct, gebaseerd op het voorgestelde azaserine degradatiemechanisme en de
gekende vatbaarheid van plaatsen op het DNA voor alkylatie. Daarna werden de gealkyleerde DNA
basen, behandeld met azaserine, vergeleken
met de synthetische standaard. Hierdoor werd
aangetoond dat 7-CMeG gevormd werd in het DNA van cellen behandeld met azaserine. Azaserine
wordt met behulp van α,β eliminatie omgezet tot diazoacetaat. Ofwel zal dit metaboliet DNA
aanvallen ofwel zal azaserine zelf reageren met DNA waarbij dihydro-alanine wordt geëlimineerd
(Zurlo et al., 1982).
FIGUUR 1.8 STRUCTUUR KDA, MNU en AS (Shuker et al., 1997; Mirvish et al., 2005)
3.3 DETECTIE VAN N-NOC DNA-ADDUCTEN
De drie hoofdstappen noodzakelijk in de analyse van DNA adducten, zijn DNA extractie,
opzuivering en isolatie, scheiding van adducten en detectie van adducten (Shuker et al., 2009).
Voor de isolatie van DNA zijn verschillende methoden voorhanden, afhankelijk van de
gewenste resultaten. Traditioneel wordt de fenol-chloroform methode gebruikt, maar tegenwoordig
wordt veel gebruik gemaakt van extractie kits voor de isolatie van kleine hoeveelheden DNA. In
12
biologische stalen zijn de concentraties DNA adducten veel lager in vergelijking met
ongemodificeerde DNA basen (Shuker et al., 2009).
Voor de scheiding en detectie van deze adducten zijn verschillende technieken beschikbaar
die afhangen van de vorm van het DNA beschikbaar voor analyse en het type DNA adduct. Vaak is
het handig om eerst de niet-specifieke DNA schade te meten vooraleer meer gespecialiseerde
technieken te gebruiken voor het onderzoek van bepaalde adducten. Vele detectiemethoden vereisen
een aanrijkingsstap om de gevoeligheid te verhogen door het verwijderen van ongemodificeerde
DNA basen of andere contaminanten die een nadeel betekenen voor de gevoeligheid (Shuker et al.,
2009). Deze aanrijking bevat de hydrolyse of enzymatische bewerking van DNA stalen tot 2‟deoxyribonucleosiden, 2‟-deoxyribonucleotiden of nucleobasen, gevolgd door technieken zoals
vloeistofextractie en HPLC, extractie van hydrofobe adducten in butanol of verdere bewerking van
ongemodificeerde basen met nuclease P1 in het geval van 32P-postlabeling.
Een derde methode die kan gebruik worden, is gecombineerde immunoaffiniteit met HPLC en
fluorescentie. Dit werd uitgevoerd met behulp van antiserum van konijnen. Antilichamen zijn niet
alleen zeer nuttig in de kwantificatie van adducten maar ook in de isolatie en opzuivering. Dit werd
gebruikt voor het maken van herbruikbare immunoaffiniteitskolommen waarin O6-CMe-dG werd
weerhouden, aangezien het antiserum zeer selectief voor de O6-CMe-dG molecule. O6-CMe-dG
werd weerhouden door de kolommen met een capaciteit van ongeveer 1 nmol. Deze interactie is zo
sterk dat drastische condities nodig waren om elutie te verkrijgen, waardoor O6-CMe-dG
gehydrolyseerd werd tot O6-CMeG. Maar omdat O6-alkylguanines meer fluorescent zijn dan hun
corresponderende deoxynucleosiden, werd dit aanzien als een voordeel (Shuker et al., 1997). Het is
zeer belangrijk om een juiste methode te kiezen want de DNA adducten kunnen ook aangetast
worden door de methode van staalname, de staalvoorbereiding en de opslag voorafgaand aan de
analyse (Shuker et al., 2009) (Tabel 1.4).
In het menselijk genoom zijn ongeveer 3x109 baseparen per cel aanwezig, terwijl in het
mitochondriaal DNA ongeveer 16600 baseparen telt. Mitochondriaal DNA is belangrijk omdat het
beschouwd wordt als een merker van de DNA adductvorming (Shuker et al., 2009). De hoeveelheid
DNA nodig voor detectie varieert van 1µg tot verschillende milligrammen. De gevoeligheid van
deze methoden is meestal 1 adduct per 106 nucleotiden tot 1 adduct per 109 nucleotiden. De meest
gevoelige methoden kunnen 1 tot 10 adducten detecteren in 1012 nucleotiden (Shuker et al., 2009).
13
TABEL 1.4 SAMENVATTING VAN DE ANALYTISCHE METHODEN GEBRUIKT VOOR
DE KWANTIFICATIE VAN DNA ADDUCTEN (Shuker et al., 2009)
Methode
Gevoeligheid
Vereiste
(adducten/bp)
hoeveelheid
Voordelen
Beperkingen
Hoge gevoeligheid
Complexe staalvoorbereiding
DNA (µg)
AMS
1-10/10
12
1-1000
14
C/3H- gelabelde component nodig
Goede opzuivering DNA nodig
Beperkte specificiteit wegens
gebrek aan structurele informatie
32
P -Postlabeling
GC-MS
1/1010
1-10
1/109
10-500
Lage hoeveelheid DNA
Grote hoeveelheden radio-activiteit
vereist
Gelimiteerde specificiteit
Gevoelig en veelzijdig
Adductstandaarden vereist
Structurele identificatie
Derivatisatie, interne standaard en
gespecialiseerd materiaal vereist
Risico op inductie van oxidatieve
DNA beschadiging
HPLC-MS/MS
1/10
9
10-100
Structurele identificatie
Gespecialiseerd materiaal en
en hoge
interne standaard nodig
nauwkeurigheid
Immunoaffiniteit/HP
1-10/10
8
20-100
LC/fluorescentie
Eenvoudige, robuuste
Enkel toepasbaar op fluorescente
methode; goedkoop
actieve adducten
Gelimiteerde
Standaarden vereist
hoeveelheid structurele
informatie vereist
vanwege het gebruik
van standaarden
Een eerste methode voor de detectie en kwantificatie van DNA is Accelerator mass
spectrometry (AMS). Dit is de meest gevoelige methode voor het meten van DNA adducten. AMS
meet specifieke radio-isotopen, waarbij
14
C en 3H het meest gebruikt worden voor de analyse van
biologische stalen. Deze techniek is gelimiteerd tot de analyse van DNA, behandeld met een radioactief gelabelde precursor. Een vergelijking van de eigenschappen van het staal met synthetische
adducten is essentieel om te garanderen dat de gedetecteerde binding kan toegeschreven worden aan
DNA adduct vorming. Daarnaast kan ook
32
P-postlabeling gebruikt worden, welke eveneens een
zeer gevoelige techniek is. Deze techniek vereist slechts een paar mg DNA. Het DNA wordt
enzymatisch omgezet tot 3‟-mononucleotiden. De hoeveelheid adducten worden aangerijkt door
14
nuclease P1 behandeling, n-butanol extractie of immunoaffiniteitchromatografie, waarna het staal
gefosforyleerd wordt met behulp van
32
P-ATP en T4 polynucleotide kinase. De resulterende
nucleosiden, 3‟,5‟-bisfosfaten, worden chromatografisch bepaald met behulp van dunne
laagchromatografie of HPLC. Er kan geen structurele informatie verkregen worden met deze
techniek.
De
meest
specifieke
detector
voor
chromatografisch
gescheiden
adducten
is
massaspectrometrie (MS). Het grootste voordeel hiermee verbonden is de ontwikkeling van de
electrospray interface, welke een directe introductie van een HPLC eluaat toelaat tot de
massaspectrometer. Voordien waren interfaces afhankelijk van gaschromatografie (GC). GC biedt
ook een zeer hoge gevoeligheid maar derivatisatie is nodig voor analyse. Van alle DNA modificatie
technieken verzekert MS de beste structurele identificatie (Shuker et al., 2009).
15
DEEL II. OBJECTIEVEN
Kanker is een veel voorkomende ziekte en is dan ook één van de belangrijkste doodsoorzaken
in de 21ste eeuw. Mutaties in het DNA vormen de basis voor de ontwikkeling van kanker. Er werd al
veel onderzoek verricht omtrent de associatie tussen vlees en kanker. Rood vlees wordt
geassocieerd met een gestegen risico op colorectale kanker en een gestegen endogene vorming van
N-nitrosoverbindingen. Binnen deze groep verbindingen wordt een onderscheid gemaakt tussen
nitrosamines en nitrosamides. Dagelijks worden mensen blootgesteld aan N-nitrosoverbindingen,
wat het belang van deze componenten aantoont. Deze N-nitrosoverbindingen zijn genotoxische
stoffen die door middel van interactie met DNA, aanleiding geven tot DNA-adducten. Deze DNAadducten ontstaan door alkylatie van het DNA. O6-methylguanine is een veel voorkomend DNAadduct. Er bestaan verschillende methoden voor de detectie en kwantificatie van deze adducten.
Tijdens dit onderzoek werd in eerste instantie een optimalisatie van de DNA-adduct analyse
methode beoogd met behulp van UHPLC-MS/MS. In een eerste experiment werd getracht de DNA
extractie en opzuivering te verbeteren. Om enig verlies van kalfthymus DNA of DNA van de Caco2 cellen te verhinderen, werd de wasstap van de pellet met 75% ethanol geëlimineerd. Ter
optimalisatie van de extractie van de adducten zelf werd beroep gedaan op meerdere SPE
kolommen, waarbij uiteindelijk gekozen werd voor de OASIS HLB (30 mg, 1 ml) kolommen. In
een derde experiment werd de werking van HCl nagegaan, om er zeker van te zijn dat de hydrolyse
daadwerkelijk plaatsvindt. In dit experiment werd eveneens de invloed van de concentratie aan
ammoniumacetaat nagegaan. Om de analyse van de gevormde DNA-adducten te verzekeren,
werden verschillende massaspectrometrische parameters aangepast en werd de analyse met
meerdere UHPLC kolommen nagegaan. Om representatieve resultaten te kunnen verzekeren,
werden ook meerdere vloeibare fases en gradiënten hiervan getest.
Een tweede doelstelling van dit onderzoek was de detectie van gevormde DNA-adducten, bij
incubatie van kalfthymus DNA of Caco-2 cellen met geselecteerde N-NOC‟s. Hiertoe werden
kaliumdiazoacetaat (KDA) en N-methyl-N-nitrosurea (MNU) gebruikt. Hiervoor werd zowel
gewerkt met kalfthymus DNA waaraan deze verbindingen in verschillende concentraties werden
toegevoegd als met Caco-2 cellen die zich in medium, waarin KDA of MNU alsook in
verschillende concentraties, bevinden. Het DNA van deze Caco-2 cellen werd verkregen door
middel van een extractie waarbij DNAzol werd gebruikt. KDA en MNU werden in gelijke
concentraties gebruikt, namelijk 5 mM, 2.5 mM, 1 mM en 0.5 mM.
16
DEEL III. MATERIAAL EN METHODEN
1. CACO-2 CELLIJNEN
De Caco-2 cellen waarmee gewerkt werd, zijn primaire of tumorale cellen, van humane
oorsprong. Ze zijn afkomstig uit de American Type Culture Collection (ATCC). Er werd gekozen
voor Caco-2 cellen omdat de meest frequentie blootstellingsplaats van N-nitrosoverbindingen het
colon is. Hierdoor is colonkanker een van de meest voorkomende kankers, geïnduceerd door Nnitrosoverbindingen. Alle handelingen met cellen gebeurden in steriele omstandigheden, door
gebruik van steriel materiaal en in een steriele omgeving (LAF).
De cellen werden gekweekt in flessen van 75 ml met vented caps, die vervaardigd zijn uit
plastiek dat gecoat is zodat de cellen zich kunnen vasthechten. Het Caco-2 medium waarin de cellen
zich bevinden, bestaat uit Dulbecco‟s modified Eagle‟s medium (DMEM) (Gibco, Merelbeke,
België), 10% foetaal kalfsserum (HyClone, Logan, UT, USA), 1% Penicilline/Streptomycine
(Peni/Strep) (Gibco, Merelbeke, België) en 1% L-glutamine (Gibco, Merelbeke, België) (Tabel
3.1). Het L-glutamine is een energiebron voor de cellen aangezien Caco-2 cellen traaggroeiend zijn.
Uit L-glutamine kan L-glutamaat gevormd worden. Penicilline en Streptomycine zijn beide
antibiotica en worden toegediend om contaminatie tegen te gaan.
TABEL 3.1 SAMENSTELLING CACO-2 MEDIUM
Bestanddeel
Hoeveelheid (%)
DMEM
88%
Foetaal kalfsserum
10%
L-glutamine
1%
Peni/strep
1%
1.1 ALGEMENE HANDELINGEN
Bij het uitzaaien (Tabel 3.2) werd gebruik gemaakt van trypsine (Gibco, Merelbeke, België),
om de cellen los te maken. Trypsine is een eiwitafbrekend enzym dat in de dunne darm voorkomt.
Het heeft een zeer specifieke functie, namelijk het splitsen van peptidebindingen waarvan de
carboxylgroep afkomstig is van één van de basische aminozuren lysine en arginine. De aanmaak
van trypsine wordt weergegeven in tabel 3.3.
17
1.2 TRYPAN BLUE
Wanneer de Caco-2 cellen voldoende confluent waren, werden ze gesplitst over verschillende
kleinere flesjes. Hierin werden telkens 106 cellen gebracht. Bij het tellen van de cellen wordt
gebruik gemaakt van een bürker-telkamer en trypaanblauw (0.5 g/100 ml) (Sigma). De kleuring met
trypaanblauw dient om de dode cellen te kunnen onderscheiden van de levende. Levende cellen zijn
namelijk in staat om deze kleurstof via exocytose terug naar buiten te brengen. Er werd een 1:1
verdunning van de celsuspensie met trypaanblauw gemaakt. Vervolgens werd de bürker-telkamer
gereinigd met ethanol en werd het dekglaasje op de bürker-telkamer geplaatst. Met behulp van een
pipet werd een deel van de verdunning onder het dekglaasje gebracht. Daarna was het mogelijk om
met behulp van een microscoop een schatting te doen van het aantal cellen aanwezig in de
celsuspensie.
TABEL 3.2 SPLITSEN VAN CELLEN
Stap
Uitvoering
1
Medium afnemen
2
2 ml trypsine toevoegen en gedurende 5 min bij 37°C laten inwerken waardoor de cellen loskomen
3
5 ml Caco-2 medium toevoegen en het geheel overbrengen in een falcon tube
4
Cellen centrifugeren (Beckman, USA) gedurende 5min bij 1500 toeren/minuut bij 25°C
5
Supernatans verwijderen en opnieuw 5 ml medium toevoegen
6
Cellen opnieuw centrifugeren
7
Supernatans verwijderen en 4 ml vers medium toevoegen
8
Homogeniseren van de pellet in het medium en 1:3 uitsplitsen
TABEL 3.3 AANMAAK VAN TRYPSINE
Component
Hoeveelheid
Trypsine diluent (Gibco, Merelbeke, België)
88 ml
NaCl
8g
KCl
0.2 g
KH2PO4
0.12 g
Na2HPO4
0.91 g
Gedestilleerd water
1000 ml
Trypsine stock (Gibco, Merelbeke, België)
10 ml
Versenaat (Gibco, Merelbeke, België)
2 ml
EDTA
2g
Trypsine diluent
100 ml
Oplossing autoclaveren en bewaren bij 4°C
18
1.3 DNA EXTRACTIE EN OPZUIVERING
DNA werd geëxtraheerd volgens twee methoden. Bij de eerste methode werd gebruik
gemaakt van een DNAzol kit. DNAzol GENOMIC DNA ISOLATION REAGENT (Brunswich
Chemie, Amsterdam, Nederland) is een compleet en klaar voor gebruik reagens voor isolatie van
genomisch DNA uit vloeibare stalen van dierlijke of plantaardige oorsprong. Deze procedure is
gebaseerd op het gebruik van een guanidine-detergent lyse oplossing dat RNA hydrolyseert en zorgt
voor selectieve precipitatie van DNA uit het cellysaat (Figuur 3.1).
FIGUUR 3.1 PRECIPITATIE DNA NA TOEVOEGING VAN ETHANOL
Het DNAzol protocol (Tabel 3.4) is snel en laat de isolatie toe van genomisch DNA van een
groot aantal stalen en van zowel kleine als grote volumina. Het bekomen DNA werd opgelost in TE
buffer (Ambion, Applied Biosystems, Lennik, België). TE buffer (pH 8.0) bestaat uit 10 mM Tris
en 1 mM EDTA.
TABEL 3.4 WERKWIJZE DNA EXTRACTIEMET DNAZOL PROTOCOL
Stap
Uitvoering
1
Medium verwijderen van de Caco-2 cellen uit de kleine falcon
2
1 ml Trypsine toevoegen en 5 min in de broedstoof plaatsen bij 37°C
3
2 ml vers Caco-2 medium toevoegen
4
Centrifugeren gedurende 5 min bij 5000 toeren per minuut bij 15-20°C
5
Supernatans verwijderen
6
De pellet oplossen in 1 ml DNAzol
7
De suspensie overbrengen in epje
8
Centrifugeren gedurende 10 min bij 10000 toeren per minuut bij 4-25°C
9
Supernatans overbrengen in een ander epje
10
0.5 ml 100% ethanol (VWR, Haasrode) toevoegen om het DNA te laten neerslaan
11
Het neergeslaan DNA overbrengen in 300 µL TE buffer
19
In een tweede methode werd gebruik gemaakt van het hexadexyltrimethyl ammonium
bromide (CTAB) protocol. De aanmaak van CTAB/NaCl wordt weergegeven in tabel 3.5. Het
gevolgde protocol wordt beschreven in tabel 3.6.
TABEL 3.5 AANMAAK CTAB/NaCl
Stap
Handeling
1
Los 4.1 g NaCl op in 80 ml water
2
Voeg traag 10 g CTAB toe tijdens het opwarmen en roeren van de oplossing. Indien nodig wordt de
oplossing opgewarmd tot 65°C om op te lossen.
3
Leng aan tot een volume van 100 ml.
TABEL 3.6 WERKWIJZE DNA EXTRACTIE MET CTAB PROTOCOL
Stap
Uitvoering
1
Medium verwijderen van de Caco-2 cellen in de kleine falcon
2
1 ml Trypsine toevoegen en 5 min in de broedstoof plaatsen bij 37°C
3
2 ml vers Caco-2 medium toevoegen
4
Centrifugeren gedurende 5 min bij 5000 toeren per minuut
5
Supernatans verwijderen
6
De pellet oplossen in 567 µl TE buffer
7
30 µl 10% SDS en 3 µl 20 mg/ml proteïnase K toevoegen
8
Laten incuberen gedurende 1 uur bij 37°C
9
100 µl 5M NaCl toevoegen en goed mengen
10
80 µl CTAB/NaCl toevoegen en goed mengen
11
Dit mengsel gedurende 10 minuten laten incuberen bij 65°C
12
800 µl chloroform/isoamyl/alcohol toevoegen
13
Centrifugeren gedurende 5 minuten in een microcentrifuge (14000
rpm)
14
Supernatans overbrengen naar een vers epje en nogmaals 800 µl
chloroform/isoamyl/alcohol toevoegen
15
Centrifugeren gedurende 5 minuten in een microcentrifuge (14000
rpm)
16
Supernatans overbrengen naar een vers epje
17
300 µl isopropanol toevoegen waardoor DNA zal precipiteren
18
Het precipitaat overbrengen in een vers epje, dat 100 µl 70% ethanol
bevat
19
Het bekomen DNA oplossen in 300 µl TE buffer
20
1.4 NANODROPMETHODE
Om te controleren of voldoende en kwalitatief DNA aanwezig was na de extractie en
opzuivering,
werd
gebruik
gemaakt
van
het
Nanodrop
toestel
(Nanodrop
ND-1000
Spectrophotometer, Isogen Lifescience, IJsselstein, Nederland) (Figuur 3.2). Dit toestel berekent de
concentratie DNA in ng/µL op basis van de gemeten absorbantie bij 260 nm. De methode zegt
eveneens iets over de zuiverheid van het staal. Deze wordt enerzijds afgeleid uit de verhouding van
de piekoppervlakten bij 260 nm (DNA) en 230 nm (eiwit). Deze verhouding ligt best tussen 1.8 en
2. Wanneer deze verhouding kleiner is dan 1.8 wijst dit op absorbantie door fenolaat, thiocyanaten
of andere organische componenten. De verhouding van de piekoppervlakten bij 260 nm (DNA) en
280 nm (RNA) is best groter dan 1.8. Wanneer deze laatste waarden lager zijn dan 1.8, kan dit
wijzen op de aanwezigheid van proteïnen, fenol of andere contaminanten die sterke absorbantie
vertonen bij 280 nm. Hierbij werd slechts 1µL staal op het oppervlak gebracht dat met behulp van
optische technologie en oppervlaktespanning op zijn plaats wordt gehouden tussen twee optische
oppervlakken.
FIGUUR 3.2 NANODROP ND-1000 SPECTROPHOTOMETER
2. UHPLC-MS/MS ANALYSE
2.1 UHPLC ANALYSE
Chromatografie laat de fysische scheiding toe van een aantal componenten in een mengsel.
Het ultra hoge druk vloeistof chromatografie (UHPLC) toestel (San José, USA) bestaat uit een
solventreservoir, een Thermo Electron Accela ultra hoge druk vloeistof chromatografisch
pompsysteem, een injector (autosampler) en een kolom (Figuur 3.3). De injectie gebeurt via de
injector in de mobiele fase waardoor het geïnjecteerde staal over de kolom wordt gestuurd onder
21
invloed van een druk, die geleverd wordt door de pomp. Wanneer het staal over de kolom wordt
gestuurd, interageren de te scheiden componenten van het staal met de stationaire fase van de
kolom. Deze componenten zullen elk afzonderlijk verschillend reageren met de stationaire fase
wegens een verschil in polariteit. Dit zal resulteren in verschillende retentietijden welke de
scheiding van de componenten toelaat. De retentietijden zijn afhankelijk van de mobiele fase, het
kolomtype en de werkingscondities van het UHPLC toestel met het debiet van de mobiele fase als
belangrijkste factor (Demeestere, 2008). Er werd gebruik gemaakt van een Waters HSS C18 kolom
(2.1 x 5 cm, 1.8 µm). Daarnaast werden tevens de kolommen Hypersil GOLD (50 x 2.1 cm, 1.9
µm) en Grace Vision HT C18P (100 x 2.1 cm, 1.5 µm) getest. De mobiele fase bestond uit 90%
ammoniumacetaat (NH4OAc) (Merck KGaA Darmstadt, Germany), 7.5% methanol (LC/MS grade)
en 2.5% acetonitrile (LC/MS grade). Het debiet waarmee de componenten over de kolom werden
gestuurd, was 300 µl/min.
FIGUUR 3.3 TSQTM VANTAGE QUADRUPOOL MASSASPECTROMETER
De stalen werden in een bepaalde volgorde gelopen. Eerst werd de standaard met een
concentratie van 100 pg/µl gelopen, ter controle van de condities van het toestel. Wanneer de
resultaten van deze run naar behoren waren, werd de standaardreeks (Tabel 3.7), gaande van staal I
tot A, gelopen, gevolgd door de stalen en afgesloten met nog een standaardreeks. Tussen de
verschillende reeksen werd methanol over de kolom gestuurd als spoeling. De monsters werden
geëlueerd volgens de gradiënt beschreven in tabel 3.8. Tijdens het onderzoek werd deze gradiënt
geoptimaliseerd om de meest optimale resolutie en piekvorm te verkrijgen voor de te bepalen analyt
en zijn interne standaard.
22
TABEL 3.7 AANGEMAAKTE STANDAARDREEKS UIT STOCKOPLOSSING O6-MeG
1ng/µL EN DE INTERNE STANDAARD CD3-O6-MeG
Staal
Concentratie
O6-MeG (µL)
Interne standaard:
2.5mMNH4OAc (µL)
6
CD3-O -MeG (µL)
A
1 ng/ml
100 van stock
100
800
B
0.75 ng/ml
75 van stock
100
825
C
0.50 ng/ml
50 van stock
100
850
D
0.25 ng/ml
250 van staal A
100
650
E
0.1 ng/ml
100 van staal A
100
800
F
0.075 ng/ml
75 van staal A
100
825
G
0.050 ng/ml
50 van staal A
100
850
H
0.025 ng/ml
250 van staal E
100
650
I
0.01 ng/ml
100 van staal E
100
800
TABEL 3.8 GRADIENT VAN DE U-HPLC
Tijd (min)
NH4OAc (2.5 mM) (%)
Methanol (%)
Acetonitrile (%)
0.00
90.0
7.5
2.5
0.50
90.0
7.5
2.5
1.50
50.0
37.5
12.5
2.50
50.0
37.5
12.5
2.51
90.0
7.5
2.5
4.00
90.0
7.5
2.5
2.2 MASSASPECTROMETRIE
De MS bestaat uit een triple quadrupole mass analyzer (TSQ Vantage, Thermo Electron, San
José, USA) waarop een verwarmde electronspray ionisatiebron (HESI II) bevestigd werd. Na de
passage van het staal doorheen het UHPLC toestel komen de componenten terecht in de
massaspectrometer waar de detectie plaatsvindt. In de eerste fase, de ionisatie, wordt gebruik
gemaakt van een verwarmde electronspray ionisatiebron (HESI II). Hierbij worden de componenten
samen met de mobiele fase via een naald in een verwarmingselement geïnjecteerd. Er treedt
verdamping van het gas op waardoor het oppervlak zal geladen zijn. Hierdoor stijgt de
oppervlaktespanning waardoor de gevormde moederionen uiteindelijk uiteen zullen vallen in
verschillende
fragmenten
(http://www.chm.bris.ac.uk/ms/theory/apci-ionisation.html).
De
gevormde ionen komen terecht in de triple quadrupool (Figuur 3.4), bestaande uit drie verschillende
compartimenten. In het eerste compartiment is een quadrupool aanwezig waarin een ion,
23
afhankelijk van het heersende frequentievoltage en de gelijkstroom al dan niet een stabiel traject
volgt langs het centrum van de vier staven, waaruit deze quadrupool is opgebouwd. De scheiding
van de ionen gebeurt op basis van hun massa/lading verhouding door het frequentievoltage en de
gelijkstroom te laten variëren. De tweede quadrupool functioneert als een collisiecel die zorgt voor
de fragmentatie van de ionen, maar ook voor de eliminatie van neutrale componenten waardoor er
een reductie van de ruis ter hoogte van de detector kan plaatsvinden. De gefragmenteerde ionen
komen uiteindelijk terecht in de derde quadrupool, waar de gevormde fragmenten opnieuw
gescheiden worden volgens hun massa/lading verhouding. Na de passage doorheen de triple
quadrupole kunnen de verschillende gescheiden fragmenten gedetecteerd worden. De analyse van
de data gebeurde met XCalibur 2.07 SP1. Onder het partim resultaten zullen de
optimalisatieparameters
besproken
worden
(http://www.chm.bris.ac.uk/ms/theory/quad-
massspec.html).
FIGUUR 3.4 VOORSTELLING VAN EEN QUADRUPOOL MASSA ANALYSATOR (Gates,
2009).
3. ANALYSE VAN DNA-ADDUCTEN
3.1 REFERENTIE MATRIX ( KALFTHYMUS DNA)
Als eerste werden stockoplossingen (1mg/ml) aangemaakt van CD3-O6-methylguanine
(MG=168.17g/mol) en O6-methylguanine. Deze stoffen werden beide verkregen bij Sigma-Aldrich.
Hiervan werd een verdunningsreeks aangemaakt zoals beschreven in tabel 3.9. Dit werd zowel
gedaan voor O6-methylguanine als voor CD3-O6-methylguanine, welke de interne standaard is.
24
Als tweede werd een oplossing van Kalfthymus DNA aangemaakt. Kalfthymus DNA werd in
een hoeveelheid van 100 mg aangekocht bij Rockland Immunochemicals, Inc. Hierbij werd 100 mg
opgelost per 50 mL.
TABEL 3.9 VERDUNNINGSREEKS VOOR O6-METHYLGUANINE EN CD3-O6METHYLGUANINE
Stocknummer
1
2
3
4
5
6
7
8
Concentratie
1mg/mL
100µg/mL
10µg/mL
1µg/mL
100ng/mL
40ng/mL
200ng/mL
8ng/mL
Ultrapuur water(µL)
900
900
900
900
900
600
800
800
Stock(µL)
100
100 van 1
100 van 2
100 van 3
100 van 4
400 van 5
200 van 4
200 van 6
Na het bereiden van deze oplossing en een verdunningsreeks van O6-methylguanine en de
interne standaard, werden de volgende stalen, zoals voorgesteld in tabel 3.10, bereid in epjes.
Daarnaast werden ook drie blancostalen bereid ter evaluatie van de eventuele aanwezigheid van
DNA-adducten of matrixinterferenties in blancostalen.
TABEL 3.10 AANGEMAAKTE STALEN
Concentratie in DNA
(ng/ml)
DNA oplossing (µL) in
TE
0
0
0
8
8
8
40
40
40
200
200
200
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
CD3-O6-MeG
O6-MeG (µl)
(40ng/mL)(µL)
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50 ultrapuur water
50 ultrapuur water
50 ultrapuur water
50 van stock 8
50 van stock 8
50 van stock 8
50 van stock 6
50 van stock 6
50 van stock 6
50 van stock 7
50 van stock 7
50 van stock 7
Vervolgens werd aan alle stalen 850 µL HCl toegevoegd. HCl werd toegevoegd om het
proces van zure hydrolyse op gang te brengen, waarbij de suikermolecule van de DNA molecule
wordt afgesplitst. De stalen werden vervolgens gedurende 30 minuten verwarmd in een op
voorhand verwarmde „heating block‟ op 80°C. Na 30 minuten werden deze in ijs geplaatst
gedurende een tiental minuten. Om de pH op 7 te brengen, werd overal 45 µL 1 M NaOH aan
toegevoegd.
25
Voor de extractie werd gebruik gemaakt van Oasis HLB (30 mg, 1 mL) SPE kolommen
(Waters, Zellik). De gevolgde procedure wordt beschreven in tabel 3.11.
Na extractie (Figuur 3.11) werden de stalen gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur
drooggedampt met behulp van de Speed Vac plus SC 210A (Labsystems). Verdere droogdamping
tot 1 druppel werd uitgevoerd met de turbovap LV onder een constante N2 stoom. Als laatste werd
100 µL 2.5 mM NH4OAc toegevoegd (Sandercock et al., 2008). De stalen werden bewaard bij 20°C in afwachting van de analyse.
TABEL 3.11 STAPPENPLAN VASTE FASE EXTRACTIE (SPE)
Stap
Handeling
1
Conditioneren met 2 mL MeOH waarbij de kolommen niet mogen komen droog staan.
2
Equilibreren met 2 mL H2O waarbij de kolommen eveneens niet droog mogen komen te staan.
3
Staaloplossing opbrengen en volledig laten doorlopen
4
Wassen met een mengsel van 5% methanol en ultrapuur water en gedurende 10min laten droogtrekken onder
een druk van -0,5.
5
Elutie van 1mL MeOH. Dit wordt opgevangen in buisjes. Deze stap wordt driemaal herhaald.
In een tweede experiment werd gewerkt met meerdere verschillende concentratie O 6-MeG
(Tabel 3.12). Vervolgens werden de stalen op dezelfde manier opgezuiverd.
TABEL 3.12 AANGEMAAKTE STANDAARDREEKS UIT STOCKOPLOSSING O6-MeG
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
Concentratie
1 mg/mL
100 µg/mL
10 µg/mL
1 µg/mL
100 ng/mL
200 ng/mL
160 ng/mL
120 ng/mL
80 ng/mL
40 ng/mL
20 ng/mL
8 ng/mL
4 ng/mL
Ultrapuur water
900 µL
900 µL
900 µL
900 µL
900 µL
4 mL
1 mL
1,25 mL
1 mL
2,5 mL
2,5 mL
4 mL
2,5 mL
Stock(µL)
100 µL
100 µL van 1
100 µL van 2
100 µL van 3
100 µL van 4
1 mL van 4
4 mL van 6
3,75 mL van 7
4 mL van 5
2,5 mL van 9
2,5 mL van 10
1 mL van 10
2,5 mL van 12
3.2 BEHANDELING VAN KALFTHYMUS DNA MET N-NOC‟S
Kalfthymus DNA (35 mg) werd in 7 ml PBS in oplossing gebracht. Waarna telkens 50 µL
KDA of MNU werd toegevoegd volgens de volgende concentratiereeks: 5, 2.5, 1 en 0.5 mM (Tabel
3.13). MNU werd verkregen bij Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA.
26
Deze stalen werden overnacht geïncubeerd (Termates, Heusden-Zolder, België) onder lichtjes
schudden in het donker bij 37°C. Vervolgens precipiteerde het DNA door toevoeging van
natriumacetaat (0.1 volume, 2.5 M) (Merck KgaA Darmstadt, Duitsland) en koude ethanol (2
volumes), waarna het gedurende 5 minuten bij 3000 g gecentrifugeerd werd.
TABEL 3.13 CONCENTRATIEREEKS KDA EN MNU IN PBS
Stalen
KDA
MNU
PBS in KDA/MNU
5 mM
69 µL 800 mM
2.58 mg
931 µL/5 ml
2.5 mM
500 µL 5 mM
500 µl 5 mM
500 µL
1 mM
250 µl 2.5 mM
250 µl 2.5 mM
750 µL
0.5 mM
500 µL 1mM
500 µl 1 mM
500 µL
De DNA pellet werd tweemaal gewassen met ethanol (Shuker et al., 1999). Na het wassen
werd de pellet opgelost in 300 µL TE buffer. Aan de verschillende stalen DNA waarvan de cellen
met verschillende concentraties KDA en MNU behandeld werden, werd 50 µL interne standaard
toegevoegd. Om de zure hydrolyse te laten doorgaan, werd 750 µL HCl toegevoegd. Voor het
verdere verloop van het experiment werd net hetzelfde gedaan als het voorgaande experiment,
beschreven in 3.1.
3.3 BEHANDELING VAN CACO-2 CELLEN MET N-NOC‟S
In dit experiment werd het medium op de Caco-2 cellen vervangen door medium waarin
kaliumdiazoacetaat (KDA) of N-methyl-N-nitrosurea (MNU) in een bepaalde concentratie werd
gebracht. Bereiding van KDA gebeurde als volgt: Ethyldiazoacetaat werd in oplossing gebracht in
KOH volgens het volgend protocol: Ethyldiazoacetaat (1.14g; 1.06mL) mengen in een oplossing
van KOH (1.136g; 2 mol eq.) in water (11.4mL) totdat het mengsel homogeen is (ong 4 uur). Dit
mengsel werd bewaard bij -80°C (Kreevoy et Konasewich, 1970).
In een eerste experiment werd er gewerkt met drie verschillende concentraties, 0 mM, 0.4 mM
en 1 mM (Tabel 3.14). Als stock werd een oplossing aangemaakt van 0.8 M of 800 mM in KOH.
Daarna werd een verdunning aangemaakt van 8 mM in Caco-2 medium.
TABEL 3.14 VERSCHILLENDE CONCENTRATIEREEKSEN KALIUMDIAZOACETAAT
A
B
C
Concentratie
0mM
0,4mM
1mM
KDA (8mM)
0 mL
1 mL
2,5 mL
Caco-2 medium
20 mL
19 mL
17,5 mL
27
Na 24 uur werd het medium waarin KDA of MNU aanwezig waren, verwijderd. Daarna
werden de cellen gelyseerd en het DNA geëxtraheerd (Lewin et al., 2006). Na het DNA in
oplossing te hebben gebracht in 300 µl TE buffer, werd dezelfde methode gevolgd zoals beschreven
onder 3.2.
Wegens negatieve resultaten in de detectie van DNA adducten in het eerste experiment, werd
een tweede experimenten opgestart met meerdere verschillende concentraties, nl. 5 mM, 2.5 mM, 1
mM en 0.5 mM gewerkt (Tabel 3.15). Aan de hoogste concentraties, 5 mM en 2.5 mM, werd HCl
toegevoegd om ervoor te zorgen dat de pH geneutraliseerd werd. Het medium werd hierbij slechts 2
uur in contact gebracht met de Caco-2 cellen. Dit tweede experiment werd eveneens uitgevoerd met
MNU, in dezelfde concentraties (Tabel 3.16) (Hebels et al., 2009). In een derde experiment werd
het tweede experiment herhaald.
TABEL 3.15 CONCENTRATIEREEKSEN TWEEDE EN DERDE EXPERIMENT KDA
Concentratie
KDA (8mM)
Caco-2 medium
A
0 mM
0 mL
20 mL
B
5 mM
12.5 mL
7.5 mL
C
2.5 mM
6.25 mL
13.75 mL
D
1 mM
2.5 mL
17.5 mL
E
0.5 mM
1.25 mL
18.75 mL
Concentratie
MNU
Caco-2 medium
A
0 mM
0 mL
20 mL
B
5 mM
18.039 mg
35 mL
C
2.5 mM
10 mL 5mM
10 mL
D
1 mM
4 mL 5mM
16 mL
E
0.5 mM
2 mL 5mM
18 mL
TABEL 3.16 CONCENTRATIEREEKSEN MNU
28
DEEL IV. RESULTATEN
1. OPTIMALISATIE VAN DE DNA-ADDUCT EXTRACTIE EN OPZUIVERING
Wegens betere resultaten werd geopteerd voor de eerste beschreven methode met DNAzol.
Ten eerste werd er in alle stalen een hogere concentratie DNA gedetecteerd wat wijst op de
gevoeligheid van het DNAzol protocol en ten tweede waren de 260/280 en 260/230 beter voor deze
methode. Als eerste werd de DNA extractie geoptimaliseerd door de stap waarin de DNA pellet
werd gewassen met 75% ethanol weg te laten wegens te veel verlies van DNA. De pellet werd
rechtstreeks na precipitatie met 100% ethanol, opgelost in 300 µL TE buffer. Wegens een negatief
resultaat in de detectie van DNA-adducten voor dit experiment, werd in een tweede experiment niet
alleen het medium, dat KDA of MNU bevat, 2 uur in contact gebracht met de Caco-2 cellen in
plaats van 24 uur maar werd ook gebruikt gemaakt van meerdere verschillende concentraties KDA
of MNU. Hiervoor werden eveneens negatieve resultaten verkregen.
De vaste fase extractie (SPE) werd geoptimaliseerd door verschillende kolommen uit te
testen: de OASIS HLB (30 mg, 1 mL) kolom, de Strata X kolom (30 mg, 3 mL) en de OASIS HLB
kolom (60 mg, 3 mL). De bekomen resultaten waren voor de eerste twee vergelijkbaar waardoor
geopteerd werd voor de goedkoopste kolommen met het minste pakkingmateriaal, nl. de OASIS
HLB kolommen (30 mg, 1 mL). Wegens het
vermoeden van een slechte invloed van het
droogdampen op de resultaten werden de kolommen bij het wassen met het mengsel 5% methanol
in water gedurende 10 minuten drooggetrokken om ervoor te zorgen dat het resterende water
verdwenen was. Deze methode werd meermaals aangepast om de zuiverheid van de stalen te
optimaliseren. Wanneer de stalen enkel drooggedampt werden met behulp van de Speedvac, bleef
een te groot volume methanol over. Daarom werd nadien getracht een kleiner volume te verkrijgen
onder een constante N2 stoom. Zo kon het volume gereduceerd worden tot een kleine druppel,
waaraan 100 µl 2.5 mM NH4OAc werd toegevoegd.
Vervolgens werd de invloed nagegaan van HCl op de opzuivering. In het protocol waarin
DNA werd opgezuiverd, werd HCl toegevoegd. Om te weten te komen of de hydrolyse plaatsvond,
werd het volgende experiment uitgevoerd. DNA werd opgelost in TE buffer in een concentratie van
100 mg per 50 ml. Hiervan werd 50 µl toegevoegd aan 850 µl 0.1 M HCl. Dit werd in zesvoud
uitgevoerd. Deze stalen werden zoals gebruikelijk in het vorige protocol, 30 minuten in de „heating
block‟ geplaatst bij 80°C. De extractiestap met behulp van de OASIS HLB kolommen (30 mg, 1
ml) en het droogdampen werden uitgevoerd zoals gebruikelijk. Na het droogdampen werd aan de
29
helft van de stalen 100 µl van het mengsel 25 mM NH4OAc, 10 ng/ml O6-methylguanine en 2
ng/ml CD3-O6-methylguanine toegevoegd. De andere helft van de stalen werd opgelost in 100 µl
van het mengsel 2.5 mM NH4OAc, 10 ng/ml O6-methylguanine en 2 ng/ml CD3-O6-methylguanine.
Een tweede doel van deze proef was de invloed bepalen van de concentratie van NH4OAc, 25 mM
of 2.5 mM en van het verschil tussen het gebruik van methanol of NH4OAC als solvent, waarin na
het droogdampen het staal werd opgelost.
In een tweede proef werd enkel de invloed nagegaan van de concentratie van NH4OAc. Dit
werd enkel uitgevoerd voor bepaalde concentraties O6-methylguanine, nl 200 ng/ml, 120 ng/ml, 40
ng/ml en 4 ng/ml. Vervolgens werd het gebruikelijke protocol opgevolgd met het verschil dat op het
einde de helft van de stalen opgelost wordt in 100 µl 25 mM NH4OAc en de andere helft in 2.5 mM
NH4OAc. In de eerste proeven werd gebruik gemaakt van 25 mM NH4OAc. Wegens problemen
met het toestel, werd gekozen voor een lagere concentratie, nl 2.5 mM. De resultaten van de twee
solventen werden ook met elkaar vergeleken. Om gevoeliger te werk te gaan, werd geopteerd voor
2.5 mM NH4OAc.
2. OPTIMALISATIE VAN DE UHPLC METHODE
Met behulp van Ultra High Performance Liquid Chromatography (UHPLC) werd getracht om
de gevormde DNA adducten in één analyse te kwantificeren. Er werden meerdere kolommen, zoals
de Hypersil GOLD (50 x 2.1, 1.9 µm), de Waters HSS C18 (2.1 x 5 cm, 1.8 µm) en de Grace vision
HT C18p (100 x 2.1 cm, 1.5 µm) getest waaruit uiteindelijk de Waters HSS C18 kolom werd
gekozen.
Bij de eerste experimenten werd gekozen voor de kolom Waters HSS C18, na negatieve
resultaten met de kolom Hypersil GOLD. Omwille van het feit dat de kolom niet bestand is tegen de
hoge druk die het solvent NH4OAc teweeg brengt, werd na enkele runs uiteindelijk gebruik
gemaakt van de kolom Grace Vision HT C18p. Om de druk enigszins te verlagen, werden
verschillende begincondities van verschillende solventcombinaties getest. Als eerste werd gebruik
gemaakt van 2.5 mM NH4OAc (solvent A), methanol (solvent B) en acetonitrile (solvent C) in de
verhouding 90/7.5/2.5. Naast deze combinatie werd ook het effect van een andere vloeibare fase
nagegaan. Hierbij werd gebruik gemaakt van 0.05% azijnzuur in ultrapuur water, dat op pH 7.0
werd gebracht door toevoeging van 0.1% ammoniumhydroxide (NH4OH) en acetonitrile in een
verhouding 98/2 (Bartels et al., 2006). Aangezien er geen verbetering in de resultaten werd
waargenomen na het lopen van de standaardreeks, werd geopteerd voor de oorspronkelijke
30
solventen, 2.5 mM NH4OAc, methanol en acetonitrile in een verhouding 90/7.5/2.5. Een hoger
gehalte aan waterig solvent kan resulteren in een betere retentie voor de meest polaire
componenten. Wanneer de componenten een te korte retentietijd vertonen (dood volume van de
kolom), zouden ze samen elueren met de solventpiek. Wegens tailing van de piek werd overgegaan
van een isocratische elutie naar een gradientelutie. In figuur 4.1 wordt het finale chromatogram
weergegeven.
C:\Xcalibur\Data\100518s14
GRACE C18P
5/18/2010 10:58:03 AM
RT: 0.00 - 3.96 SM: 11G
RT: 0.00 - 3.96 SM: 11G
RT: 2.44
AA: 59384
SN: 133
100
NL: 3.67E3
m/z= 66.64-67.64 F: + c ESI SRM
ms2 166.140 [67.141-67.143,
121.102-121.104,
134.085-134.087,
149.099-149.101] MS ICIS
100518s14
Relative Abundance
80
60
40
20
0
RT: 2.44
AA: 56637
SN: 115
100
m/z= 120.60-121.60 F: + c ESI
SRM ms2 166.140
[67.141-67.143,
121.102-121.104,
134.085-134.087,
149.099-149.101] MS ICIS
100518s14
Relative Abundance
80
60
40
20
0
RT: 2.44
AA: 90883
SN: 280
100
m/z= 133.59-134.59 F: + c ESI
SRM ms2 166.140
[67.141-67.143,
121.102-121.104,
134.085-134.087,
149.099-149.101] MS ICIS
100518s14
Relative Abundance
60
40
20
0
RT: 2.44
AA: 570390
SN: 1532
100
m/z= 148.60-149.60 F: + c ESI
SRM ms2 166.140
[67.141-67.143,
121.102-121.104,
134.085-134.087,
149.099-149.101] MS ICIS
100518s14
80
60
40
20
0
NL: 4.98E3
RT: 2.42
AA: 61209
SN: 123
NL: 3.88E3
RT: 2.42
AA: 115176
SN: 240
NL: 7.09E3
RT: 2.42
AA: 608929
SN: 462
NL: 3.66E4
m/z= 69.56-70.56 F: + c ESI SRM
ms2 169.160 [70.159-70.161,
107.086-107.088,
134.095-134.097,
152.118-152.120] MS ICIS
100518s14
60
40
20
100
m/z= 106.52-107.52 F: + c ESI
SRM ms2 169.160
[70.159-70.161,
107.086-107.088,
134.095-134.097,
152.118-152.120] MS ICIS
100518s14
80
60
40
20
100
m/z= 133.52-134.52 F: + c ESI
SRM ms2 169.160
[70.159-70.161,
107.086-107.088,
134.095-134.097,
152.118-152.120] MS ICIS
100518s14
80
60
40
20
0
NL: 3.30E4
RT: 2.42
AA: 80022
SN: 185
80
0
NL: 5.44E3
80
100
0
NL: 3.48E3
Relative Abundance
Relative Abundance
1 ng O6-MeG + 1 ng ISTD - NIEUW
100
m/z= 151.54-152.54 F: + c ESI
SRM ms2 169.160
[70.159-70.161,
107.086-107.088,
134.095-134.097,
152.118-152.120] MS ICIS
100518s14
80
60
40
20
0
0
1
2
3
0
1
Time (min)
2
3
Time (min)
FIGUUR 4.1 CHROMATOGRAM VAN DE VERSCHILLENDE TRANSITIES VAN 1
NG O6-METHYLGUANINE en O6-D3-METHYLGUANINE
31
3. OPTIMALISATIE VAN DE MS/MS DETECTIE
Er werd gekozen voor een triple quadrupool massaspectrometer, de TSQ, waarbij alleen
productionen worden gedetecteerd wat zorgt voor een hoge gevoeligheid en resolutie. In eerste
instantie werd de HESI II bron aangepast. Hiertoe werd eerst de ringstand in verschillende posities
geplaatst, waarbij ringstand B de beste resultaten gaf. Daarna werd de zijdelingse groef op 0
gebracht en de middelste schroef op 1.5. De HESI II bron werd zowel in de positieve als in de
negatieve modus getest, tijdens de infusie van O6-methylguanine en CD3-O6-methylguanine. Er
werd gekozen voor de positieve modus wegens duidelijk hogere signalen. Door infusie van beide
componenten werden het moederion en vier productionen bepaald. Ook de MS paramters zoals de
S-lens, de splitsingsenergie, de polariteit en de retentietijdvensters werden geoptimaliseerd. De
bekomen resultaten worden weergegeven in tabel 4.1.
TABEL
4.1
O6-METHYLGUANINE
en
CD3-O6-METHYLGUANINE
MET
HUN
PRODUCTIONEN, SPLITSINGSENERGIE, RETENTIETIJDVENSTER, S-LENS VOLTAGE
EN POLARITEIT
Moedermolecule
Dochtermolecule
Splitsingsenergie
Retentietijdvensters
S-lens (V)
Polariteit
166.038
67.030
33
[0.66; 1.66]
89
+
166.038
107.036
29
[0.66; 1.66]
89
+
166.038
134.023
23
[0.66; 1.66]
89
+
166.038
149.030
18
[0.66; 1.66]
89
+
169.053
70.058
32
[0.64; 1.64]
93
+
169.053
107.020
28
[0.64; 1.64]
93
+
169.053
134.025
23
[0.64; 1.64]
93
+
169.053
152.044
18
[0.64; 1.64]
93
+
In tweede instantie werden ook nog enkele algemene parameters aangepast, zijnde de looptijd,
de filter piekbreedte, de Q1 piekbreedte, de cyclustijd, de capillaire temperatuur, de vaporizer
temperatuur,… . De cyclustijd heeft een belangrijke invloed op het aantal punten over de piek. Dit
dient tussen de 12 en de 20 te zijn. Een verkorting van de piek zou meer punten over de piek
betekenen. De overige parameters werden achtereenvolgens aangepast door variërende waarden in
te geven en de detectie van de standaarden op de voet te volgen. De bekomen resultaten worden
weergegeven in tabel 4.2.
32
TABEL 4.2 ALGEMENE PARAMETERS VAN DE HESI II BRON EN TSQ
TSQ Vantage Instrumentmethode
Looptijd
4 minuten
Experiment type
Selectieve reactie monitoring (SRM)
Chrom. Filter piekbreedte (s.)
10.0
Q1 piekbreedte (FWHM)
0.70
Cyclustijd (s.)
2.000
Capillaire temperatuur
270.0
Vaporizer temperatuur
200
Sheath gas druk (arbitraire eenheden)
25.0
Ion sweep gas druk (arbitraire eenheden)
2.0
Auxilliar valve flow (arbitraire eenheden)
5.0
Spray voltage positieve polariteit (V)
4500
Ontladingsstroom (µA)
4.0
Injectievolume (µl)
10.0
Autosampler tray temperatuur (°C)
10.0
Kolomoven temperatuur (°C)
35.0
3.1 KWANTIFICATIE VAN O6-METHYLGUANINE
Om de lineariteit en herhaalbaarheid van de analysemethode te beoordelen, werd een
standaardcurve aangemaakt in eluens (2.5 mM NH4OAc) op basis van een concentratiereeks van
0.01 ng/ml, 0.025 ng/ml, 0.05 ng/ml, 0.075 ng/ml, 0.1 ng/ml, 0.25 ng/ml, 0.5 ng/ml, 0.75 ng/ml en 1
ng/ml. De piekoppervlakteverhoudingen (piekoppervlakte O6-MeG ten opzichte van de
piekoppervlakte van CD3-O6-MeG) werden vervolgens uitgezet in functie van de concentratie.
Hieraan werd een lineaire trendlijn gefit. De correlatiecoëfficient hiervan was groter dan 0.99
(Figuur 4.2) wat betekent dat de methode als lineair kan beschouwd worden. Bij dit experiment
werden lage RSD waarden teruggevonden. Naarmate de concentratie lager wordt, wordt de RSD
waarde groter aangezien de detectielimiet meer wordt benaderd. Dit toont de herhaalbaarheid van
dit experiment aan.
Voor de kwantificatie van O6-methylguanine werd een standaardreeks in matrix (DNA)
geanalyseerd. Gelijklopend werd ook een standaardreeks in eluens geanalyseerd. Deze laatste werd
uitgevoerd ter controle van de piekoppervlaktes, retentietijden en signaal/ruis verhouding, waardoor
de gevoeligheid van de TSQTM Vantage nauwlettend kan gevolgd worden. In figuur 4.3 wordt de
curve van de standaardreeks in DNA weergegeven met correlatiecoëfficiënt.
33
Piekoppervlakteverhouding
3.000
y = 1.078x + 0.006
R² = 0.993
2.500
2.000
1.500
1.000
0.500
0.000
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
Concentratie O6-methylguanine (ng/ml)
Piekoppervlakteverhouding
FIGUUR 4.2 STANDAARDREEKS IN ELUENS
5
4.5
4
3.5
3
2.5
2
1.5
1
0.5
0
y = 0.017x + 0.022
R² = 0.997
0
50
100
Concentratie O6-methylguanine
150
200
FIGUUR 4.3 STANDAARDREEKS IN DNA
4. ADDUCTVORMING DOOR N-NOC’S IN KALFTHYMUS DNA
In deze proef werd calfthymus DNA rechtstreeks in contact gebracht met de N-nitroso
verbindingen KDA of MNU en dit gedurende 24 uur. Via de geoptimaliseerde SPE extractie en
UHPLC-MS/MS methode werden de stalen geanalyseerd. Hiervoor werden positieve resultaten
bekomen met betrekking tot de vorming van O6-MeG DNA-adducten voor KDA (Figuur 4.4). Er
werd een mooi lineair verband teruggevonden tussen de verschillende concentraties KDA en de
gemiddelde piekoppervlakteverhouding.
34
18
Gemiddelde
piekoppervlakteverhouding
16
y = 2.617x - 0.398
R² = 0.930
14
12
10
8
6
4
2
0
0
1
2
3
Concentratie KDA (mM)
4
5
FIGUUR 4.4 STANDAARDCURVE KALFTHYMUS DNA BEHANDELD MET
VERSCHILLENDE CONCENTRATIES KDA
5. ADDUCTVORMING DOOR N-NITROSOVERBINDINGEN IN CACO-2 CELLEN
In een eerste experiment werden Caco-2 cellen 24 uur in contact gebracht met Caco-2
medium waarin KDA in een bepaalde concentratie, nl. 0 mM, 0.4 mM of 1 mM aanwezig was.
Vooraleer het DNA geëxtraheerd werd, werden de cellen geteld met behulp van de „trypan blue‟
exclusie methode. De resultaten hiervan worden weergegeven in tabel 4.3.
TABEL 4.3 GEMIDDELD AANTAL CELLEN ±SD (N=3) AANWEZIG IN KDA MEDIUM
Concentratie (mM)
0
6
3.1x10 ±5.10
0.4
5
6
1
2.9x10 ±4.10
5
2.8x106±4.105
Na de extractie werd het DNA opgelost in TE buffer. Om er zeker van te zijn dat DNA in een
bepaalde concentratie aanwezig was, werd de nanodropmethode gebruikt. Belangrijke parameters
hierbij zijn de 260/280 en 260/230 verhoudingen. Zoals vermeld is de verhouding 260/280 best
groter dan 1.80 en de verhouding 260/230 best groter dan 0.2. De resultaten hiervan worden
weergegeven in tabel 4.4.
TABEL 4.4 GEMIDDELDE VERHOUDINGEN 260/280 EN 260/230 ±SD
(N=3)VOOR DE VERSCHILLENDE KDA CONCENTRATIES
Concentratie (mM)
260/280
260/230
0
1.91±0.04
0.36±0.36
0.4
1.94±0.04
0.43±0.22
1
1.93±0.06
0.36±0.35
35
In een tweede experiment werden de Caco-2 cellen slechts 2 uur in contact gebracht met
Caco-2 medium waarin KDA of MNU in verschillende concentraties aanwezig is. Het aantal cellen
werd eveneens nagegaan vooraleer de extractie van het DNA plaatsvond. De resultaten hiervan
worden weergegeven in tabel 4.5 en 4.6. Hierop werd de student‟s t-test toegepast waarbij werd
vastgesteld dat het aantal cellen bij een concentratie van 5 mM KDA significant verschillend is van
0 mM en 0.5 mM. Voor MNU is deze significantie enkel geldig ten opzichte van 0.5 mM.
TABEL 4.5 GEMIDDELD AANTAL CELLEN ±SD (N=9) AANWEZIG IN KDA MEDIUM
Concentratie (mM)
0
0.5
6
3.3x10 ±2.10
5
1
6
3.5x10 ±7.10
4
2.5
6
3.0x10 ±7.10
4
5
6
2.4x10 ±9.10
4
1.9x106±4.104*°
*= significant verschillend van de 0 mM (p<0.05), °= significant verschillend van de 0.5 mM (p<0.05)
TABEL 4.6 GEMIDDELDE AANTAL CELLEN ±SD (N=9) AANWEZIG IN MNU MEDIUM
Concentratie (mM)
0
6
3.4x10 ±1.10
0.5
5
6
3.0x10 ±9.10
1
4
6
2.5
2.7x10 ±1.10
5
6
2.3x10 ±4.10
5
5
1.8x106±8.104°
°= significant verschillend van de 0.5 mM (p<0.05)
Eveneens werden voor deze stalen de verschillende 260/280 en 260/230 verhoudingen
nagegaan. De resultaten worden weergegeven in tabel 4.7 en 4.8.
TABEL 4.7 DE GEMIDDELDE VERHOUDINGEN 260/280 EN 260/230 ±SD
MET N=9 VOOR DE VERSCHILLENDE KDA CONCENTRATIES
Concentratie
260/280
260/230
0 mM
2.15±0.23
0.22±0.10
0.5 mM
2.82±0.22
0.36±0.30
1 mM
2.24±0.28
0.21±0.12
2.5 mM
2.43±0.66
0.39±0.34
5 mM
2.15±0.19
0.38±0.53
In deze proef werden de stalen ook onderworpen aan een analyse met behulp van UHPLCMS/MS. Hiervoor werden negatieve resultaten verkregen. Ondanks dat de extracties goed
uitgevoerd werden, of m.a.w de interne standaarden werden aan gelijke concentraties als in
vergelijking met eerdere testen gedetecteerd werden geen O6-MeG adducten waargenomen.
36
TABEL 4.8 DE GEMIDDELDE VERHOUDINGEN 260/280 EN 260/230 ±SD
MET N=9 VOOR DE VERSCHILLENDE MNU CONCENTRATIES
Concentratie
260/280
260/230
0 mM
2.02±0.21
0.34±0.31
0.5 mM
2.08±0.12
0.27±0.13
1 mM
2.07±0.13
0.46±0.39
2.5 mM
2.18±0.25
0.21±0.13
5 mM
2.09±0.16
0.18±0.13
37
DEEL V. DISCUSSIE
1. INLEIDING
Aanwijzingen zijn voorhanden dat er een associatie bestaat tussen de consumptie van vlees en
het risico op kanker bij de mens. Hiervoor bestaan verschillende verklaringen. In dit onderzoek
werd de hypothese nagegaan omtrent het feit dat de vorming van N-nitrosoverbindingen de link zou
vormen tussen de consumptie van vlees en een gestegen risico op kanker bij de mens. Dit verband
werd reeds aangetoond in eerdere onderzoeken. In eerste instantie hierbij ging men de blootstelling
aan nitraat en nitriet van de mens onderzoeken. Deze twee verbindingen vormen de
sleutelverbindingen in de activiteit van N-nitrosoverbindingen in de aanleiding tot kanker. Van de
meeste van deze verbindingen werd hun genotoxische activiteit reeds vastgesteld. Nnitrosoverbindingen worden omgezet in reactieve componenten die reageren met het DNA, dat zo
mutaties gaat vertonen en DNA-adducten gaat vormen. N-nitrosoverbindingen uiten hun
genotoxische activiteit in de vorming van deze adducten. Daarom hebben we ons in dit onderzoek
gericht op de detectie en de kwantificatie van de gevormde DNA-adducten. Gedurende de
proefopzet werd de DNA adductvorming activiteit nagegaan van kaliumdiazoacetaat (KDA) en Nmethyl-N-nitrosurea (MNU). Er werd voor deze stoffen gekozen omdat hun genotoxische activiteit
aangetoond werd in de studie van Shuker et al. (2007). De genotoxische activiteit van KDA werd
nagegaan via een behandeling van een plasmide, die de humane p53 cDNA sequentie bevatte, met
KDA. Dit gaf onmiddellijk aanleiding tot detecteerbare hoeveelheden O6-MeG en O6-CMeG. Voor
MNU werd zelfs een groter aantal mutaties waargenomen (Shuker et al., 2007).
2. OPTIMALISATIE VAN DE UHPLC-MS/MS METHODE
De methode die ontwikkeld werd voor de analyse van de DNA-stalen, werd uitgevoerd op de
UPHLC (HESI II) TSQTM Vantage massaspectrometer. Dit toestel is één van de meest recente in
zijn soort. De methode werd stap voor stap geoptimaliseerd om tot een betrouwbare en gevoelige
analyse te komen. In figuur 4.1 en 4.2 werden de standaardreeks in eluens en de standaardreeks in
matrix (DNA) grafisch voorgesteld. Hierbij werd vastgesteld dat de curve van de standaardreeks in
matrix iets lager lag dan deze van de standaardreeks in eluens. Dit kan te wijten zijn aan
matrixeffecten waardoor een ionisatiesuppressie ontstaat. Een tweede reden kan zijn dat er nooit
100% extractie-efficiëntie is. Maar normaalgezien zou de interne standaard hiervoor moeten
corrigeren.
38
3. ADDUCTVORMING VAN N-NOC’S IN DNA
3.1 ADDUCTVORMING DOOR N-NITROSOVERBINDINGEN IN KALFTHYMUS DNA
Het kalfthymus DNA werd behandeld met verschillende concentraties KDA of MNU in PBS.
O6-MeG adducten werden gedetecteerd en gekwantificeerd met behulp van SPE opzuivering,
gevolgd door UHPLC-MS/MS. In een eerste experiment werd enkel gebruik gemaakt van KDA.
Shuker et al. (2007) gebruikte niet alleen PBS als buffer waarin het DNA werd opgelost, maar ook
Tris-EDTA. Er werden twee door KDA geïnduceerde spectra opgesteld, waaruit bleek dat ze
vergelijkbaar waren en in de toekomst beschouwd konden worden als één spectrum. De mutaties
die Shuker vaststelde voor KDA en MNU, waren voornamelijk GCAT transities, die op hun beurt
aanleiding gaven tot de vorming van de DNA adducten, O6-MeG en O6-CMeG. In het labo waren
wij niet in staat om deze transities na te gaan bij de behandeling van kalfthymus DNA met KDA.
Maar er werden wel positieve resultaten bekomen na analyse van de verschillende stalen met behulp
van UHPLC-MS/MS, waarbij een dosisafhankelijke stijging te zien was van het aantal O6-MeG
adducten. Er werd een mooi lineair verband vastgesteld tussen de aanwezige concentraties KDA en
een lage variatiecoëfficient in de gemiddelde piekoppervlakteverhouding, wat wijst op de goede
herhaalbaarheid van dit experiment. De bekomen resultaten suggereren dat methylatie aan O6 van
guanine een algemene eigenschap blijkt te zijn van N-nitrosoverbindingen (Shuker et al., 1999). Er
was eveneens de intentie om een analyse uit te voeren op het DNA-adduct O6-CMeG, waarvoor
contact werd opgenomen met Prof. Moore, aangezien hun labo in de mogelijkheid is om deze
component te synthetiseren. Wegens te late respons was dit echter niet meer mogelijk. Om dit
experiment te kunnen optimaliseren, werd het nogmaals uitgevoerd. Wegens verlies van DNA,
werd de wasstap eveneens geëlimineerd. Tijdens deze herhaling werd ook de activiteit van MNU
nagegaan. Wegens problemen met het toestel, werden hiervoor negatieve resultaten bekomen.
3.2 ADDUCTVORMING DOOR N-NITROSOVERBINDINGEN IN CACO-2 CELLEN
In een eerste experiment werd gewerkt met KDA in slechts drie verschillende concentraties, 0
mM, 0.4 mM en 1 mM. Wegens de negatieve resultaten in de detectie van DNA-adducten werd
overgegaan tot een tweede experiment waarbij met meerdere verschillende concentraties KDA of
MNU werd gewerkt, 0 mM, 0.5 mM, 1 mM, 2.5 mM en 5 mM. Hiervoor werden eveneens
negatieve resultaten bekomen in de detectie van DNA-adducten. Een reductie van de contacttijd van
de Caco-2 cellen van 24 uur tot 2 uur met het medium met meerdere verschillende concentraties
KDA of MNU, kon echter niet leiden tot positieve resultaten. Wegens de vaststelling dat bij een
herhaling van deze proef met meerdere verschillende concentraties KDA of MNU eveneens geen
39
significantie hoeveelheden DNA-adducten gemeten werden, is het noodzakelijk een andere
oplossing te vinden zodat er wel een detectie kan plaatsvinden met behulp van UHPLC-MS/MS.
Door de aanhoudende negatieve resultaten werd aan twee mogelijke oorzaken gedacht. Een eerste
mogelijkheid is dat het DNA weerstandig is aan het hydrolyserend effect van HCl, waardoor de
suikercomponenten niet van de DNA molecule zullen gesplitst worden. Een tweede mogelijkheid is
een zekere resistentie van de Caco-2 cellen aan de carcinogene stoffen, KDA en MNU, waardoor er
geen DNA-adducten zullen gevormd worden. De vorming van DNA-adducten werd reeds
aangetoond in HT-29 cellen (Lewin et al., 2006). Daarom zou nog bijkomend onderzoek kunnen
gedaan worden op Caco-2 cellen. Daarbij zouden de carcinogene stoffen KDA en MNU
rechtstreeks aan het geëxtraheerde DNA van de Caco-2 cellen kunnen toegevoegd worden.
Bij beide experimenten werd het aantal cellen geteld na het in contact brengen met het met
N-NOC‟s gespikete medium. De resultaten hiervoor werden weergegeven in tabel 4.3, 4.5 en 4.6.
Daaruit kan men afleiden dat naargelang de concentratie van KDA of MNU stijgt, er een lichte
significante daling te zien is in het aantal cellen aanwezig in het genotoxisch medium. De inhibitie
van de celgroei waardoor een daling van het aantal cellen wordt waargenomen, welke
dosisafhankelijk is, kan mogelijk het gevolg zijn van de gelimiteerde groei en proteïnesynthese
gedurende deze incubatieperiode (Vanhaecke et al., 2008). KDA en MNU uiten hun genotoxische
activiteit in de vorming van alkylerende componenten, waardoor het DNA onherstelbaar beschadigd
wordt. Het is duidelijk dat voor cellen met onherstelbare DNA beschadiging de enige overblijvende
optie apoptose is. Vanhaecke et al. (2008) toonde een daling van het aantal Caco-2 cellen aan, na
contact met een genotoxische stof. Deze daling werd verklaard door een daling van de
mitochondriale activiteit, de membraanintegriteit en de proteïnesynthese van de Caco-2 cellen op
een tijd- en dosisafhankelijke manier.
Naast het tellen van de cellen, werden ook de verhoudingen 260/280 en 260/230 nagegaan
voor alle stalen met behulp van de nanodropmethode. Voor de verhouding 260/280 werden in het
eerste experiment waarden gevonden kleiner dan 2 maar groter dan 1.8. In het tweede experiment
werd een verhouding groter dan 2 waargenomen. Zoals reeds aangehaald, zegt deze verhouding iets
over de zuiverheid van het DNA en RNA. In het verkregen DNA van het tweede experiment was er
dus minder sprake van contaminatie in vergelijking met het eerste experiment. Daarnaast werd ook
voor alle stalen de verhouding 260/230 nagegaan. Voor beide experimenten zijn deze resultaten
uitzonderlijk laag. Deze kunnen verklaard worden door de aanwezigheid van guanidine thiocyanaat
40
in het voor DNA extractie gebruikte DNAzol. Guanidine thiocyanaat vertoont een absorptie van UV
bij 260 nm.
41
DEEL VI. CONCLUSIE
Vele studies tonen aan dat de nitrosatie van precursorbevattende voedselbestanddelen, een
belangrijke bron is in de synthese van alkylerende componenten, welke een bewezen genotoxische
activiteit bezitten. Een eerste doelstelling van deze studie was de optimalisatie van de verschillende
methoden in de detectie van DNA-adducten. Deze optimalisatie bestond ten eerste uit een
verbetering van de DNA extractie en de opzuivering. Daarna vond een optimalisatie van de UHPLC
methode plaats gevolgd door een aanpassing van de MS parameters. Het tweede doel was het
detecteren en kwantificeren van het DNA-adduct O6-MeG in Caco-2 cellen en kalfthymus DNA na
behandeling met N-NOC verbindingen, KDA en MNU. Er werden positieve resultaten verkregen
voor het kalfthymus DNA, waarbij een lineair verband werd vastgesteld tussen de concentratie
KDA en de gemiddelde piekoppervlakteverhouding. Voor de Caco-2 cellen bleven enige resultaten
uit. In een volgend onderzoek zou alle aandacht kunnen gericht worden op de Caco-2 cellen en hun
gedrag in de vorming van DNA-adducten. Er is weinig bekend over de vorming van DNA adducten
in Caco-2 cellen waardoor dit een belangrijk terrein voor onderzoek kan zijn.
42
DEEL VII. REFERENTIES
Bartels,
M. J., Zhang,
F., Pottenger, L. H., Gollapudi, B. B., Schisler, M. R. (2006).
Simultaneous quantitation of 7-methyl- and O6-methylguanine adducts in DNA by liquid
chromatography-positive electrospray tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography, 833,
141-148.
Bartsch, H., Ohshima, H., Pignatelli, B., Calmels, S. (1992). Endogenously formed N-nitroso
compounds and nitrosating agents in human cancer etiology. Pharmacogenetics, 2, 272-277.
Bingham, S. A., Collins, A. R., Azqueta A., Lecommandeur, E., Barrow, T. M., Aspinall, S.
M., Kuhnle, G. C., Joosen, A. M. C. P. (2009). Effect of processed and red meat on endogenous
nitrosation and DNA damage. Carcinogenesis, 30 no. 8, 1402-1407.
Bingham, S. A., Lunn, J. C., Moore, K. P., Mani, A. R., Reda, T., Story, G. W., Kuhnle, G. C.
(2007). Diet-induced endogenous formation of nitroso compounds in the GI tract. Free Radical
Biology & Medicine, 43, 1040-1047.
Böhmer, F-D., Veeriah, S., Pool-Zobel, B. (2005). Modulation of xenobiotic metabolising
enzymes by anticarcinogens-focus on glutathion S-transferases and their role as targets of dietary
chemoprevention in colorectal carcinogenesis. Mutation Research, 591, 74-92.
Brambilla, G. & Martelli, A. (2007). Genotoxic and carcinogenic risk to humans of drug-nitrite
interaction products. Mutation Research, 635, 17-52.
De Bont, R. & Van Larebeke, N. (2003). Literatuuronderzoek nitraten en nitrieten.
Demeyer, D., Honikel, K., De Smet, S. (2008).The World Cancer Research Fund report 2007: A
Challenge for the meat processing industry. Meat Science, 80, 953-959.
Demeestere, K. (2008). Chemische analysetechnieken partim organisch. Cursus binnen de
opleiding 3de Bachelor in de Bio-ingenieurswetenschappen Universiteit Gent, België.
43
Demopoulos, N. A., Vlachodimitropoulos, D., Vlastos, D., Stephanou, G (1996). A comparative
study on the effect of MNU on human lymphocyte cultures in vitro evaluated by O6-mdG
formation, micronuclei and sister chromatid exchanges induction. Cancer letters, 109, 109-114.
Dietrich, M., Block, G., Pogoda, J. M., Buffer, P., Hecht, S., Preston-Martin, S. (2005). A
review: dietary and engogenously formed N-nitroso compounds and risk of childhood brain tumors.
Cancer Causes and Control, 16, 619-635.
Guza, R., Ma, L., Fang, Q., Pegg, A. E., Tretyakova, N. (2009). Cytosine Methylation Effects on
the Repair of O6-methylguanines within CG Dinucleotides. The Journal of Biological Chemistry,
284 no. 34, 22601-22610.
Hebels, D. G. A. J., Jennen, D. G. J., Kleinjans, J. C. S., de Kok, T. M. C. M. (2009). Molecular
Signatures of N-nitroso Compounds in Caco-2 Cells: Implications for Colon Carcinogenesis.
Toxicological sciences, 108(2), 290-300.
Hogg, N. (2007). Red meat and colon cancer: Heme proteins and nitrite in the gut. A commentary
on “Diet-induced endogenous formation of nitroso compounds in the GI tract”. Free Radical
Biology & Medicine, 43, 1037-1039.
Kreevoy, M. M., Konasewich, D. E. (1970). The Mechanism of Hydrolysis of Diazoacetate Ion.
The Journal of Physical Chemistry, 74 no. 26, 4464-4472.
Krul, C. A. M., Zeilmaker, M. J., Schothorst, R. C., Havenaar, R. (2003). Intragastric formation
and modulation of N-nitrosodimethylamine in a dynamic in vitro gastrointestinal model under
human physiological conditions. Food and Chemical Toxicology, 42, 51-63.
Kryptopoulos, S. A., Souliotis, V. L., Chhabra, S. K., Anderson, L. M. (1996). DNA damage
studies related to the assessment of the role of N-nitroso compounds in human cancer. European
Journal of Cancer Prevention, 5 (Supplement 1), 109-114.
Lewin, M. H., Bailey, N., Bandaletova, T., Bowman, R., Cross, A. J., Pollock, J., Shuker, D. E.
G., Bingham, S. A. (2006). Red Meat Enhances the Colonic Formation of the DNA Adduct O6Carboxymethyl Guanine: Implications for Colorectal Cancer Risk. Cancer Res, 66.
44
Lundberg, J. O., Weitzberg, E., Cole, J. A., Benjamin, N. (2004). Nitrate, bacteria and human
health. Nature reviews Microbiology, 2, 593-601.
Michaud, D. S., Holick, C. N., Batchelor, T. T., Giovannucci, E., Hunter, D. J. (2009).
Prospective study of meat intake and dietary nitrates, nitrites, and nitrosamines and risk of adult
glioma. The American Journal of Clinical Nutrition, 90, 570-577.
Mirvish, S. S. (1995). Role of N-nitroso compounds (NOC) and N-nitrosation in etiology of
gastric, esophageal, nasopharyngeal en bladder cancer and contribution to cancer of known
exposures to NOC. Cancer Letters, 93, 17-48.
Rostkowska, K., Zwierz, K., Rozanski, A., Moniuszko-Jakoniuk, J., Roszczenko, A. (1998).
Formation and metabolism of N-nitrosamines. Polish Journal of Environmental Studies, 7 no. 6,
321-325.
Sandercock, L. E., Hahn, J. N., Luchman, H. A., Giesbracht, J. L., Peterson, L. A., Jirik, F. R.
(2008). Mgmt deficiency alters the in vivo mutational spectrum of tissues exposed to the tobacco
carcinogen 4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone (NNK). Carcinogenesis, 29 no. 4, 866874.
Shuker, D. E. G., Bingham, S. A., Pollock, J. R. A., Goodman, J. M., Glen, R. C.,
Frankenfield, C., Mai, V., Kuhnle, G., Lunn, J. C. (2007). The effect of haem in red and
processed meat on the endogenous formation of N-nitroso compounds in the upper gastrointestinal
tract. Carcinogenesis, 28 no. 3, 685-690.
Shuker, D. E. G., Burns, P. A., Scott, G. B., Gottschalg, E. (2007). Potassium diazoacetateinduced p53 mutations in vitro in relation to formation of O6-carboxymethyl- and O6-methyl-2‟deoxyguanosine DNA adducts: relevance for gastrointestinal cancer. Carcinogenesis, 28 no. 2, 356362.
45
Shuker, D. E. G., Challis, B. C., Fairhurst, N., Harrison, K. L. (1997). Synthesis,
characterization, and immunochemical detection of O6-(carboxymethyl)-2‟-deoxyguanosine: A
DNA adduct formed by nitrosated glycine derivatives. Chem. Res. Toxicol., 10, 652-659.
Shuker, D. E. G., Cooper, D. P., Jukes, R., Harrison, K. L. (1999). Detection of concomitant
formation of O6-carboxymethyl- and O6-methyl-2‟-deoxyguanosine in DNA exposed to nitrosated
glycine derivatives using a combined immunoaffinity/HPLC method. Chem. Res. Toxicol.,12, 106111.
Shuker, D. E. G., Persaud, R., Martin, E. A., Kim, J. H., Farmer, P. B., Cadet, J., Boogaard,
P. J., Himmelstein, M. W. (2009). Creating context for the use of DNA adduct data in cancer risk
assessment: II. Overview of methods of identification and quantitation of DNA damage.Critical
Reviews in Toxicology, 39(8), 679-694.
Stuff, J. E., Goh, E. T., Barrera, S. L., Bondy, M. L., Forman, M. R. (2009). Construction of an
N-nitroso database for assessing dietary intake. Journal of Food Composition and Analysis.
Terasaki, M., Totsuka, Y., Nishimura, K., Mukaisho, K., Chen, K., Hattori, T., TakamuraEnya, T., Sugimura, T., Wakabayashi, K. (2008). Detection of endogenous DNA adducts, O6carboxymethyl-2‟-deoxyguanosine and 3-ethanesulfonic acid-2‟-deoxycytidine, in the rat stomach
after duodenal reflux. Cancer Sci, 99 no. 9, 1741-1746.
Vanhaecke, L., Derycke, L., Le Curieux, F., Lust, S., Marzin, D., Verstraete, W., Bracke, M.
(2008). The microbial PhIP metabolite 7-hydroxy-5-methyl-3-phenyl-6,7,8,9tetrahydropyrido[3‟,2‟:4,5]imidazol[1,2-a]pyrimidin-5-ium chloride (PhIP-M1) induces DNA
damage, apoptosis and cell cycle arrest towards Caco-2 cells. Toxicology Letters, 178, 61-69.
Williams, P. (2007). Nutritional composition of red meat. Nutritions and Dietetics 200, 64 (Suppl.
4), S113-S119.
World Health Organization (1978). Nitrates, Nitrites and N-Nitroso Compounds International
programme on chemical safety.
46
Zurlo, J., Curphey T. J., Hiley, R., Longnecker, D. S. (1982). Identification of 7carboxymethylguanine in DNA from Pancreatic Acinar Cells Exposed to Azaserine. Cancer
Research, 42, 1286-1288.
http://www.chm.bris.ac.uk/ms/theory/apci-ionisation.html (22/03/10)
http://www.chm.bris.ac.uk/ms/theory/quad-massspec.html (22/03/10)
47