Samenvatting - VU Research Portal

Samenvatting
Biofysica van het enkele molecuul tot het gehele
organisme
Op deze laatste paar pagina’s van mijn proefschrift zal ik u een bondige
Nederlandstalige samenvatting geven. Het hier gepresenteerde werk valt
daarbij uiteen in twee delen: de biofysica van het enkele molecuul, en die
op het niveau van het gehele organisme. Wie de levende wereld echt wilt
begrijpen, zal daarbij een causale en kwantitatieve brug moeten kunnen
slaan tussen deze enorm verschillende schalen van lengte en complexiteit.
Ik hoop dat het werk in dit boekje daarbij een kleine bijdrage zal kunnen
leveren, aan elk van beide kanten.
Na de algemene introductie (hoofdstuk 1) staat allereerst een biofysische
meettechniek centraal: het optisch pincet (Engels: optical tweezers). Hiermee kunnen we microscopisch kleine objecten ‘vastpakken’ en manipuleren,
en tegelijk de uitgeoefende krachten nauwkeurig meten. Dit stelt ons in
staat om van één enkel DNA-molecuul, aan de beide uiteinden verbonden
met een micrometer-groot plastic kogeltje, de mechanische en elastische
eigenschappen met grote precisie te bepalen. Die eigenschappen veranderen als het DNA bezet wordt door, bijvoorbeeld, relevante eiwitten uit de
cel — en uit die veranderingen kunnen we opmaken hoe die eiwitten hun
werk doen.
In hoofdstuk 2 combineren we het optisch pincet met fluorescentiemicroscopie. Door het combineren van de twee technieken in één apparaat
krijgen we toegang tot ruimtelijke informatie over het DNA, en zicht op
wat zich op het DNA afspeelt. Zo kunnen we direct visualiseren waar ei-
159
Samenvatting
witten op het DNA binden, als ook hoeveel. Het uit de mitochondriën
(energie-producerende organellen van een levende cel) afkomstige eiwit
TFAM gebruiken we in dit hoofdstuk als voorbeeld, aan de hand waarvan we drie verschillende implementaties van fluorescentiemicroscopie met
elkaar vergelijken. Epifluorescentie is de eerste en meest eenvoudige implementatie, en stelt ons al in staat om te zien dat TFAM monomerisch, coöperatief bindt; onafhankelijk van de op het DNA staande spankracht bindt
en loslaat; en bovendien ook lineair diffundeert op het DNA. Confocale
fluorescentiemicroscopie, de tweede implementatie, reduceert het volume
van zowel fluorescente excitatie als detectie sterk, en onderdrukt daarmee
achtergrondsignalen van niet-gebonden eiwitten in de oplossing. Daarmee
kunnen we naar veel hogere, en meer realistische, eiwitconcentraties kijken.
De toevoeging van STED (geSTimuleerde Emissie–Depletie), tot slotte,
maakt het mogelijk om de fundamentele diffractielimiet te omzeilen. Het
excitatievolume wordt nog verder gereduceerd door gestimuleerde emissie in een donut-vormige ring rondom het excitatievolume, voorafgaand
aan detectie. (Voor het ‘ééndimensionale’ DNA worden overigens twee
‘STED-strepen’ gebruikt in plaats van een donut.) Dankzij de combinatie
confocaal/STED kunnen we nu TFAM zien binden onder hoge concentraties in de oplossing, en bovendien de diffusie over het DNA in veel groter
detail volgen.
Uit de resultaten die genoemd worden in hoofdstuk 2, volgt een model
voor de wijze waarop TFAM het DNA bindt en comprimeert. Na binding
diffundeert een TFAM-molecuul lineair over het DNA, tot het een cluster
stabiel gebonden TFAM-eiwitten tegenkomt, en zelf ook stabiel bindt. De
gevonden bindingscoöperativiteit ontstaat dus door een stabilisering van
diffunderend TFAM door reeds stabiele clusters van het eiwit. De wijze
waarop naburige TFAM-eiwitten elkaar ‘voelen’ hangt samen met een voorgesteld compressiemechanisme van lokale denaturatie van het DNA.
Hoofdstuk 2 bevat, tot slot, ook nog een aantal richtlijnen voor het maken van een keuze uit de drie genoemde fluorescentietechnieken, als men
deze wil combineren met het optisch pincet. Epifluorescentie is daarbij in
160
Samenvatting
het algemeen de meest aantrekkelijke optie: gemakkelijk te implementeren, compatibel met typische biologische experimentele systemen, en met
weinig photobleking. In bepaalde extreme gevallen, die bijvoorbeeld hoge
eiwitconcentraties of hoge spatiotemporele resolutie vereisen, kunnen confocale en/of STED-microscopie echter een uitkomst zijn.
In hoofdstuk 3 kijken we in meer detail naar het bepalen van de elastische eigenschappen van DNA uit kracht–extensie-curves (metingen waarbij de veranderende kracht bepaald wordt tijdens het langzaam uitrekken
van het DNA tussen de plastic kogeltjes). Door het fitten van theoretische modellen van DNA-elasticiteit aan kracht–extensie-curves, krijgen we
belangrijke informatie over de structuur van het DNA, en hoe deze verandert door de aanwezigheid van bijvoorbeeld eiwitten (TFAM), of ionen
in de oplossing. Het veel gebruikte model van de uitrekbare worm-achtige
keten (‘extensible worm-like chain’, eWLC) was eerder al uitgebreid tot
de twistbare worm-achtige keten (‘twistable worm-like chain’, tWLC). Het
tWLC-model voegt een beschrijving toe van de koppeling tussen strekking
en twist (draaiing) van DNA’s dubbele helix. Belangrijk is daarbij dat
DNA opwindt bij uitrekking, in plaats van ontwindt (tot een spankracht
van ∼ 35 pN). We ontwikkelen in dit hoofdstuk een robuuste fitmethode,
waarbij de twist–strek-koppeling gevangen wordt in twee fitparameters g0
en g1 . Hiermee wordt deze informatie over twist–strek-koppeling in het
regime van hoge spankrachten op het DNA (∼ 30–65 pN) voor het eerst
eenvoudig toegankelijk. We passen de fitmethode toe op DNA-data gemeten bij verschillende concentraties divalent magnesiumzout (0–150 mM,
in een achtergrond van 500 mM monovalent natriumchloride). De veranderingen in divalente zoutconcentratie blijken geen effect te hebben op
de elasticiteitsmodulus en persistentielengte van het dubbelstrengs DNA,
maar wel op de twist–strek–koppelingsparameter g1 : deze neemt bijna 15%
af. Dit duidt op een stabilisatie van de twist van dubbelstrengs DNA door
hoge concentraties van divalent zout.
Het tweede gedeelte van dit proefschrift — de hoofdstukken 4 en 5 —
draaien om C. elegans. Dit is een wormpje van ca. een millimeter groot,
161
Samenvatting
dat al decennia lang gebruikt wordt als modelorganisme in de moleculaire
biologie en celbiologie. Het is relatief eenvoudig organisme met ca. 1000
lichaamscellen (waaronder 302 neuronen), dat toch verrassend complex
gedrag vertoont: associatief leren, adaptatie, imprinting, chemotaxis —
en zelfs iets dat op slaap lijkt. Op deze veel grotere lengteschaal dan die
van de eerste hoofdstukken, stellen we vragen over gedrag: hoe kwantificeer
je zoiets ongrijpbaars, en hoe koppel je het aan onderliggende cellulaire en
moleculaire mechanismen?
Hoofdstuk 4 bouwt voort op een in 2008 ontwikkelde methode om
het motorisch gedrag van C. elegans volledig en objectief te kwantificeren. In een video van een in twee dimensies rondkruipende worm, wordt
in elk plaatje de ‘ruggengraat’ van de worm bepaald. Deze middenlijn is
een eenvoudige kromme, en wordt gekarakteriseerd door het opmeten van
100 ‘raakhoeken’ langs de middenlijn. Als principale-componentenanalyse
(PCA) op de uit de video afgeleide 100-dimensionale tijdserie wordt toegepast, blijkt dat elke lichaamspose van de worm kan worden beschreven
als een lineaire combinatie van slechts vier principale componenten, ook
wel eigenwormen genoemd. Daarmee wordt het volledige gedrag van de
worm gereduceerd tot een veel eenvoudiger te ‘behappen’ tijdserie van vier
dimensies, ook wel te interpreteren als een curve door een vierdimensionale
faseruimte. Deze oorspronkelijke eigenworm-analyse is echter onmogelijk
op het moment dat de worm zijn eigen lichaam kruist: de ontstane zelfoverlap brengt de bepaling van de middenlijn in de war. Een dergelijke
situatie treedt op tijdens de zogenaamde omega-manoeuvres: een significant vaak voorkomend en belangrijk stukje gedrag, waarbij de worm een
scherpe bocht maakt in de vorm van de griekse letter Ω. Een allesomvattende analyse van de bewegingsdynamica van de worm tijdens bijvoorbeeld
de ontsnappingsrespons of chemotaxis was hierdoor onmogelijk.
We presenteren in hoofdstuk 4 een potentiële oplossing voor dit gat:
een omgekeerd algoritme voor het bepalen van het lichaamspostuur van
de worm. De crux zit hem er daarbij in dat men, voor een willekeurige
lineaire combinatie van de vier eigenwormen, altijd een afbeelding van de
162
Samenvatting
worm kan reconstrueren. Deze reconstructie is altijd mogelijk ; zelfs voor
complexe lichaamsvormen met zelf-overlap. Het postuurprobleem reduceert daardoor tot de taak om de lineaire combinatie van eigenwormen op
te sporen, waarvoor de gereconstrueerde afbeelding het meest lijkt op de
oorspronkelijke. Een implementatie van dit omgekeerde algoritme vereist
daarbij drie ingrediënten: (1) een wiskundige functie die precies kwantificeert in hoeverre twee afbeeldingen van een worm op elkaar lijken; (2) een
efficiënte methode om het minimum van deze functie in de faseruimte op
te sporen; en (3) een manier om de intrinsieke ambiguïteit van sommige
videobeelden op te lossen.
Onze implementatie van het omgekeerde algoritme blijkt uitstekende
resultaten op te leveren voor wijd uiteenlopende posturen van C. elegans.
Daardoor kunnen we nu de omega-manoeuvre in meer detail analyseren,
bijvoorbeeld als de eerder genoemde curve in een faseruimte. De omegamanoeuvre blijkt een superpositie te zijn van de slang-achtige kruipbeweging van de worm (een cirkel in de faseruimte), en een puls in de derde
dimensie. Een dergelijke superpositie is consistent met reeds bekende moleculaire mechanismen voor de omega-manoeuvre tijdens een ontsnappingsrespons. Belangrijker is dat we de geobserveerde omega-manoeuvres uiteen zien vallen in twee verschillende groepen, op basis van de amplitude
van de puls. De eerste groep omvat de ‘klassieke’ omega-manoeuvre; de
tweede een nog niet eerder als afzonderlijk beschreven groep van diepere
lichaamsbuigingen die zich voordoen tijdens vrij kruipgedrag.
Tot slot, in hoofdstuk 5, gaan we in meer detail in op twee datasets
met video’s van kruipgedrag in C. elegans. In de eerste krijgt de worm een
thermische stimulus toegediend op het hoofd (met een precies gecontroleerde infrarood laserbundel). Daarop vertoont de worm een onmiddellijke
ontsnappingsrespons: een snel achteruit kruipen, gevolgd door een scherpe
bocht (de eerder genoemde omega-manoeuvre). De bocht blijkt een precies gecontroleerde heroriëntatie van gemiddeld 180◦ te behelzen: weg van
de stimulus. Direct voor en na de omega-manoeuvre treedt er nog extra
heroriëntatie op, wat in verband te brengen valt met reeds bekende neurale
163
Samenvatting
en moleculaire mechanismen. Een hypothese voor de manier waarop de
worm de heroriëntatie van 180◦ bewerkstelligt, zou kunnen zijn dat het
zijn eigen lichaam op de tast als ‘richtingaanwijzer’ gebruikt om zich van
de stimulus weg te bewegen.
De tweede dataset bevat langere video’s van vrij rondkruipende wormen. Zoals in hoofdstuk 4 opgemerkt, vallen de omega-manoeuvres uiteen in twee groepen. Hoewel de manoeuvres uit de twee groepen op het
oog sterk verschillen, zijn de bijbehorende trajecten door de faseruimte
gelijkvormig: alleen de amplitude van de puls langs de derde principale
component (eigenworm) verschilt duidelijk. De resulterende heroriëntatie van de worm blijkt ook verschillend: de ‘klassieke’ omega-manoeuvre
leidt tot een ventrale heroriëntatie; de ‘nieuwe’ delta-manoeuvre tot een
dorsale, middels een ‘doorsteek’ door de ventrale zijde. We laten zien dat
beide groepen statistisch onafhankelijk zijn, maar wel met ongeveer gelijke
frequentie optreden, en dat ook blijven na adaptatie. Dit alles suggereert
dat de omega- en delta-manoeuvres wellicht een gezamenlijke neurale infrastructuur hebben.
164