DNA in het gerechtelijk onderzoek

1
DNA in het gerechtelijk onderzoek
Een didactisch model voor gebruik in de klas
Gebaseerd op het gelijknamige artikel Roels, P. & V. Goethals (2000), Jaarboek van de
Vereniging voor het Onderwijs in de Biologie (VOB) 171-180.
ABSTRACT
Op basis van het gebruik van DNA in het gerechtelijk onderzoek wordt hier een didactisch
model voorgesteld dat toelaat dat leerlingen met papieren DNA-stroken ten gronde ontdekken
hoe het knippen van DNA met knipenzymen en de scheiding van DNA-fragmenten op een
agarosegel in zijn werk gaan. Op het einde van de oefening zullen de leerlingen voor een
fictieve moord in staat zijn de dader aan te duiden door vergelijking van de bekomen
genetische “vingerafdrukken”; het geheel is dan ook zeer concreet gemaakt voor de
leerlingen.
LITERATUUR
Decorte, R. (1997)
Moleculaire biologie in de rechtbank: genetische identificatie en vaderschapsbepaling.
PDL Lustrumsymposium – Biotechnologie: 46-54. KULeuven.
Frants, R.R. (1991)
Kopieën kopiëren. De polymerase-kettingreactie.
Natuur & techniek 59: 182-193.
Groeneveld, E.R. (1990)
Misdaadanalyse. Het oplossend vermogen van de natuurwetenschappen.
Natuur & Techniek 58: 412-425.
Logtenberg, H. & E. Bakker (1987)
DNA in de getuigenbank.
Natuur & Techniek 55: 842-853.
Roels, P., V. Goethals, E. Smets & F. De Meuter (1996)
Restrictiefragment-lengte polymorfisme. Didactisch model voor een belangrijke DNAtechniek.
Bulletin voor het Onderwijs in de Biologie 27: 206-212.
(zie elders op deze CD-rom)
Van de Grint, L. (1996)
DNA experiment ‘meisje vermoord’.
Bulletin voor het Onderwijs in de Biologie 27: 213-215.
2
INLEIDING
De revolutionaire ontwikkelingen in de moleculaire biologie en biotechnologie van de laatste
twee decennia zijn niet beperkt gebleven tot de wetenschappelijke wereld, maar beïnvloeden
reeds volop ons dagelijks leven. Denken we maar aan de introductie van genetisch
gemodificeerd plantenmateriaal in onze voeding (vb. maïs), de diagnose van bijvoorbeeld
erfelijke aandoeningen en de aanmaak op grote schaal van insuline door bacteriën. Wellicht is
dit nog maar het begin.
In het gerechtelijk onderzoek wordt reeds jaren gezocht naar en gebruik gemaakt van alle
mogelijke sporen ter identificatie van personen (zie Groeneveld 1990 voor een algemeen
overzicht). Tot voor kort waren bruikbare biologische kenmerken slechts onrechtstreeks
gebaseerd op genetische factoren, bijvoorbeeld serumeiwitten en ABO-bloedgroepen uit
bloedvlekken. Sinds de tweede helft van de jaren ’80 heeft het DNA zelf ook in het
gerechtelijk onderzoek zijn intrede gedaan. Het DNA is immers veel stabieler dan de eerder
bestudeerde eiwitten, zodat oudere en minder goed bewaarde biologische sporen kunnen
onderzocht worden. Bovendien levert het nauwkeuriger informatie op waardoor personen
makkelijker definitief kunnen geëlimineerd worden van de lijst der verdachten of verdachten
met grote waarschijnlijkheid als dader kunnen aangeduid worden. We verwijzen naar
Logtenberg & Bakker (1987) en Decorte (1997) voor een overzicht van de grote
ontwikkelingen in dit domein.
Op basis van het gebruik van DNA in het kader van de misdaad wordt hier een didactisch
model voorgesteld dat toelaat dat leerlingen spelenderwijs ten gronde ontdekken hoe het
knippen van DNA met knipenzymen en de scheiding van DNA-fragmenten op een agarosegel
in zijn werk gaan. Op het einde van de oefening zullen de leerlingen voor een fictieve moord
in staat zijn de dader aan te duiden door vergelijking van de bekomen genetische
“vingerafdrukken”. Hierbij wordt geen echt DNA gebruikt1, maar papieren stroken, die DNAmoleculen voorstellen. Een vergelijkbaar model met betrekking tot restrictiefragment-lengte
polymorfismen (RFLP) werd reeds eerder gepubliceerd en succesvol toegepast (Roels et al.
1996). Daarbij lag de nadruk, naast de begrippen knipenzym en agarosegel, op het
achterhalen van de onderliggende mutaties van het door de leerlingen zelf ontdekte
polymorfisme. In het hier voorgestelde model wordt een DNA-polymorfisme gebruikt om een
moordenaar te identificeren; het geheel is daarom zeer concreet voor de leerlingen. Verder
oefenmateriaal en informatie omtrent dit onderwerp worden ter beschikking gesteld door het
Europees Initiatief voor Biotechnologie Educatie (huidige URL: http://www.ipn.unikiel.de/eibe, zie hun eenheid 2: “DNA profiling”).
DE THEORIE
De genetische informatie van het leven is opgeslagen in de structuur van het
desoxyribonucleïnezuur (DNA) dat bij de mens onder de vorm van 46 chromosomen in de
kern van lichaamscellen aanwezig is. Daarnaast bevatten ook de mitochondriën DNA. De
nucleotiden, de elementaire bouwstenen van het DNA, vertegenwoordigen vier “letters” die
onderling verschillen door de organische base die erin is ingebouwd (Adenine, A; Cytosine,
C; Guanine, G; Thymine, T). Drie opeenvolgende nucleotiden (een codon) in het DNA
coderen voor een aminozuur in het uiteindelijk opgebouwde proteïne. Gedurende de evolutie
1
Ondertussen zijn reeds verscheidene jaren kits op de markt, met echt DNA, knipenzymen en agarose, waarmee
de leerlingen effectief aan de slag kunnen om bijvoorbeeld een moord op te lossen (Van de Grint 1996). Hoewel
deze kits ontegensprekelijk een extra dimensie kunnen toevoegen aan deze oefening en ze laten uitgroeien tot
een heus practicum, zijn ze uiteraard kostelijker en tijdrovender dan het hier voorgestelde “papieren” model.
3
ontstaan er in het DNA op toevallige wijze veranderingen, zogenaamde mutaties, waardoor
individuen tot stand komen die genetisch verschillend zijn. Voorbeelden van mutaties zijn o.a.
de omzetting van een bepaalde base in een andere (base-substitutie) of het bijkomen (insertie)
of verdwijnen (deletie) van één of meerdere basen in het DNA. Het gevolg van een mutatie
kan een verandering van een aminozuur in een eiwit tot gevolg hebben, zoals bij
sikkelcelanemie (tengevolge van een base-substitutie). Mutaties kunnen echter ook
fenotypisch onopgemerkt blijven, maar via modern onderzoek zichtbaar gemaakt worden
door het bestuderen van bijvoorbeeld RFLP’s (restrictiefragment-lengtepolymorfismen).
Naast coderende sequenties, komen in het erfelijk materiaal van onze chromosomen grote
hoeveelheden niet-coderende sequenties voor die ofwel gelegen zijn tussen de coderende
gebieden binnen één gen (de zogenaamde introns) of tussen de genen zelf. Hun functie is niet
steeds opgehelderd. Vaak komen in deze niet-coderende gebieden talrijke, op elkaar volgende
kopies voor van eenzelfde kleine basissequentie1. Deze basissequentie is op zichzelf hooguit
enkele tientallen basenparen lang en komt voor in een aantal varianten. Het DNA ter hoogte
van deze kopies noemt men repetitief DNA. Het is bovendien zeer polymorf: de lengte van
deze segmenten, die afhangt van het aantal kopies dat van de basissequentie voorkomt, kan
sterk variëren van persoon tot persoon. Onderzoek van polymorf, repetitief DNA laat toe de
zogenaamde “genetische” vingerafdruk van personen op te stellen. We bespreken nu concreet
hoe het onderzoek hierbij verloopt.
Het geïsoleerde DNA van de onderzochte personen of ontdekte sporen wordt in fragmenten
geknipt met zogenaamde knipenzymen of restrictie-enzymen. Een knipenzym herkent een
welbepaalde, voor dat enzym specifieke, opeenvolging van meestal vier tot zes basenparen in
het DNA (de herkenningssequentie) en zal het DNA telkens ter hoogte van een dergelijke
sequentie “doorknippen”. Meestal wordt het DNA-molecule hierbij asymmetrisch
doorgeknipt waardoor een DNA-streng aan de uiteinden één tot enkele basen langer of korter
is dan de complementaire DNA-streng. Deze zogenaamde “kleverige” einden zijn in de
biotechnologie belangrijk, omdat ze toelaten verschillende fragmenten geknipt met eenzelfde
knipenzym weer met elkaar te laten binden. Hier zullen we om praktische redenen gebruik
maken van een knipenzym dat zijn herkenningssequentie symmetrisch doormidden knipt,
namelijk Hae III met herkenningsequentie 5’ GGCC 3’ (zie figuur 1).
3’ CCGG 5’
De gebruikte knipenzymen zijn nu zo gekozen dat uit het chromosomaal DNA onder andere
de gebieden met het repetitief DNA worden vrijgemaakt. De zo bekomen fragmenten, die
vergelijkbaar zijn tussen individuen, zullen nu in lengte verschillen naargelang het aantal
kopies dat van de basissequentie in het beschouwde individu voorkomt. Om de lengte te
bestuderen en te vergelijken worden de met een knipenzym behandelde DNA-monsters op
een agarosegel aangebracht en de fragmenten gescheiden volgens hun grootte
(gelelektroforese).
Dit gebeurt door het negatief geladen DNA onder invloed van een elektrisch veld door de gel
te laten migreren (naar de positieve pool toe). Kleinere fragmenten ondervinden hierbij een
geringere weerstand van de agarosegel en migreren sneller naar de overzijde. Grotere
fragmenten doen er langer over. Uiteindelijk worden de gescheiden banden gevisualiseerd en
1
Men spreekt van zogenaamde VNTR’s (“Variable Number of Tandem Repeats”). Eerst werd gebruik gemaakt
van basissequenties van enkele tientallen basenparen lang, waarvan het aantal kopies relatief groot is.
Tegenwoordig wordt, omwille van een aantal praktische voordelen, eerder gebruik gemaakt van basissequenties
die slechts twee tot vijf basenparen lang zijn en waarvan een beperkter aantal kopies voorkomt. Dit zijn
zogenaamde STR’s (“Short Tandem Repeats”). De onderliggende principes blijven echter dezelfde.
4
de bekomen patronen vergeleken (zie figuur 1). Daarbij worden meestal selectief de banden
van het repetitief DNA gevisualiseerd. De vele andere banden die door het knippen van de
chromosomen zijn bekomen en die het beeld alleen maar complexer maken, worden niet
gevisualiseerd. In Roels et al. (1996) worden in figuur 3 de verschillende stappen in een
studie naar het RFLP schematisch voorgesteld.
Figuur 1. Voorstelling van twee dubbelstrengse DNA-moleculen met aanduiding van de plaatsen waar het
knipenzym Hae III zijn herkenningssequentie 5’ GGCC 3’ symmetrisch doorknipt en resultaat van
gelelektroforese
3’ CCGG 5’
op de bekomen DNA-fragmenten. Het lengteverschil tussen fragmenten “kort 1” en “lang 3” is volledig te
wijten aan een verschillend aantal kopies van de basissequentie 5’ AGGC 3’.
3’ TCCG 5’
Om selectieve visualisering te bekomen, wordt gebruik gemaakt van de Southern-vlektechniek, die reeds in vele handboeken beschreven is. De met een agarosegel gescheiden
DNA-fragmenten worden enkelstrengs gemaakt en op een herbruikbare en bewaarbare (nylon
of cellulosenitraat) membraan overgebracht (blotten). Daarna voegt men een oplossing met
gemerkte DNA-sondes toe, die opgebouwd zijn uit de basissequentie van het bestudeerde
repetitief DNA en eveneens enkelstrengs zijn gemaakt. Voor de merking maakt men gebruik
van radioactiviteit of chemische kleuringstechnieken. Door complementaire basenparing
zullen de DNA-sondes binden (DNA-hybridisatie) op de kopies van de basissequentie van de
gescheiden fragmenten op de membraan. Uitsluitend deze banden zullen daarna op een film
oplichten. De positie van de band op de membraan bepaalt de lengte van het gevisualiseerde
fragment.
5
Om de stap van selectieve visualisering te omzeilen en bovendien te kunnen vertrekken van
uitgangsmateriaal van een lagere kwantiteit en kwaliteit, wordt tegenwoordig vaak afgestapt
van de hoger beschreven RFLP-gebaseerde techniek en gebruik gemaakt van de polymerasekettingreactie (zie Frants 1991 voor een algemeen overzicht). Hiermee wordt het mogelijk
cellen uit bijvoorbeeld het weinige speeksel op sigarettenpeuken of eventueel sterk
gedegradeerd DNA afkomstig uit beenderen te bestuderen. Hiervoor moeten eerst kleine
stukjes DNA (primers) aangemaakt worden die door complementaire basenparing op de
grenzen van het repetitief DNA binden. Zij zorgen er dan tijdens de polymerase-kettingreactie
voor dat deze fragmenten selectief en veelvuldig worden gekopieerd.
UITWERKING VAN HET DIDACTISCH MODEL
De aangeboden DNA-monsters onder de loep
Er worden in het model drie types DNA-moleculen aangeboden (figuur 2), afkomstig van een
slachtoffer en twee verdachten. Om het model eenvoudig te houden wordt van de 46
chromosomen uitsluitend een kort DNA-fragment aangeboden met twee gescheiden gebieden
niet-coderend, repetitief DNA (verder repetitief DNA I en II genoemd), aan de uiteinden
telkens geflankeerd door een kort stukje coderend DNA met unieke (= niet-repetitieve)
sequentie. Aan de grenzen van repetitief DNA I en II komt telkens een herkenningssequentie
voor van het te gebruiken knipenzym Hae III met herkenningssequentie 5’ GGCC 3’.
3’ CCGG 5’
Figuur 2. Schematische voorstelling van drie types DNA-moleculen. Voor elke type is in vetjes de
herkenningssequentie van knipenzym Hae III aangeduid, evenals de afbakening van de kopies van de
basissequenties in de beide gedeelten met repetitief DNA.
Elk DNA-monster zal dus door het knipenzym in vijf fragmenten worden geknipt (zie figuur
3). De fragmenten afkomstig van de flankerende zones van het repetitief DNA, komen bij alle
personen voor. De lengte van het repetitief DNA verschilt bij de drie personen; het wordt
bepaald door het aantal kopies dat van de basissequentie voorkomt. Om te wijzen op het feit
dat nog andere verschillen kunnen voorkomen tussen het DNA van personen, werd in het
centraal gelegen niet-repetitief DNA van verdachte 2 een deletie van vier basenparen
aangebracht (zie later).
6
Figuur 3. Schematische voorstelling van het te bekomen fragmentenpatroon na behandeling van de DNAmoleculen van het slachtoffer en de verdachten met knipenzym Hae III met herkenningssequentie 5’ GGCC 3’.
3’ CCGG 5’
Klassikale uitvoering
De leerlingen wordt verteld dat er volgend op wat een vechtpartij lijkt een moord is gebeurd,
waarbij op de kleding van het slachtoffer een grote bloedvlek werd aangetroffen die mogelijks
van de dader afkomstig is. Ook zijn reeds twee verdachten aangehouden. De bedoeling van
het onderzoek is nu aan te tonen of één van beide verdachten inderdaad de dader is. Hiervoor
zijn bloedstalen afgenomen van alle betrokken personen met de bedoeling een genetische
“vingerafdruk” te construeren. Ook uit de teruggevonden bloedvlek is DNA geïsoleerd.
Vervolgens wordt kort ingegaan op de theoretische achtergrond van de genetische
“vingerafdruk”. Er wordt tevens meegedeeld dat voor de eenvoud van het model geen 46
chromosomen, maar slechts één papieren strook met twee gebieden repetitief DNA wordt
gebruikt. Men wijst er echter op dat dit in de werkelijkheid met de techniek van knipenzymen
a priori niet mogelijk is, maar dat het probleem daar omzeild wordt door selectieve
visualisering achteraf. Op de eigenlijk theorie achter deze visualisering hoeft niet te worden
ingegaan.
7
Vervolgens wordt kort het verloop van de oefening geschetst. De oefening kan geschieden in
groepjes van twee of vier, naargelang de klasgrootte. Aan elk groepje wordt een werkblad met
de DNA-monsters van de drie personages bezorgd (kopie van figuur 4). Daarnaast bezorgt de
leraar elk groepje een apart DNA-monster afkomstig van de bloedvlek.
Figuur 4. Werkblad voor de leerlingen waarop de DNA-fragmenten van het slachtoffer, verdachte 1 en
verdachte 2 zijn voorgesteld.
De leerlingen gedragen zich in eerste instantie als knipenzym en gaan in de bekomen papieren
DNA-strook op zoek naar de herkenningsseqentie van het knipenzym om het DNA op deze
plaats door te knippen. Elke leerling kan naargelang de groepsgrootte één of twee DNAmonsters overlopen en knippen. Daarna wordt van elk fragment het aantal basenparen geteld
en op het fragment geschreven. Dan leggen de leerlingen van eenzelfde groep voor elk DNAmonster telkens de bekomen fragmenten van groot naar klein zoals dat door scheiding in een
agarosegel zou gebeuren. De verschillende DNA-monsters liggen naast elkaar. Een alternatief
is de fragmenten op een blad, waarop tevens een lengtereferentie is aangebracht, te laten
opkleven. Nu kunnen de leerlingen uitgaande van het bekomen patroon uitmaken van wie de
gevonden bloedvlek afkomstig is.
Naargelang het type DNA-molecule dat de leraar voor het bekomen DNA van de bloedvlek
meegeeft aan een groepje, kan een verschillend besluit getrokken worden, dat ter controle aan
de leraar wordt voorgelegd. Zo kan het bloed van het slachtoffer afkomstig blijken te zijn
zodat de verdachten op deze basis niet als moordenaar geïdentificeerd kunnen worden.
8
Anderzijds is het mogelijk dat het bloed van één der verdachten afkomstig is, zodat deze op
basis van zijn genetische “vingerafdruk” met grote waarschijnlijkheid als moordenaar kan
aangeduid worden.
De leerlingen kunnen tot slot, in het kader van een eventuele korte klassikale bespreking, de
individuele basissequenties van het repetitief DNA zoeken en aanduiden.
Klassikale bespreking
Indien de leerlingen de basissequenties van repetitief DNA I en II tellen, kunnen ze merken
dat de verschillende lengte van vergelijkbare fragmenten tussen de personen te wijten is aan
het aantal aanwezige kopies van de basissequentie.
Ook valt op dat in repetitief DNA I en II niet dezelfde basissequentie voorkomt.
Verder kan door de leerlingen nagegaan worden dat het 15 basenpaar lange fragment van
verdachte 2 overeenstemt met het 19 basenparen lange fragment bij personen één en twee, op
de afwezigheid van vier basenparen na. Hiermee kan benadrukt worden dat naast mutaties in
de repetitieve DNA-fragmenten ook elders mutaties kunnen voorkomen.
Wel dient erop gewezen te worden dat deze stappen geen onderdeel meer uitmaken van het
eigenlijk gerechtelijk onderzoek, aangezien de onderzoekers geen idee hebben van de
onderliggende basenpaaropeenvolging van de bestudeerde fragmenten. De onderzoekers
nemen slechts banden in een gel waar.
Tot slot valt op dat personen in een bepaald fragment repetitief DNA eenzelfde aantal kopies
van de basissequentie kunnen bezitten, waardoor deze fragmenten op basis van hun lengte
niet kunnen onderscheiden worden. Zo bezitten verdachten 1 en 2 in repetitief DNA II telkens
vier kopies van de basissequentie, zodat deze personen op basis van dit fragment alleen niet
zouden te onderscheiden zijn. Daarmee kan het belang benadrukt worden dat meerdere
fragmenten repetitief DNA moeten betrokken zijn in het gerechtelijk onderzoek.