In Situ Hybridisatie in de routine pathologie diagnostiek

In Situ Hybridisatie
in de routine pathologie diagnostiek
Winand Dinjens
Afdeling Pathologie
Josephine Nefkens Instituut (JNI)
Erasmus MC, Rotterdam
Pathologendagen; 11 april 2007, Ede
In Situ Hybridisatie (ISH):
*
Methode om nucleïne zuren (DNA en RNA)
zichtbaar te maken in hun natieve locatie in de
cel (in situ)
*
Gebaseerd op de affiniteit die complementaire
DNA of RNA strengen voor elkaar hebben
(hybridisatie) en het zichtbaar maken van die
interactie
In Situ Hybridisatie (ISH):
*
Vorm van “affiniteits cyto/histochemie”:
Immunocyto/histochemie:
specifieke interactie antilichaam - antigeen
In situ hybridisatie:
specifieke interactie probe – target DNA/RNA
(hybridisatie)
en het zichtbaar maken van die interacties
In Situ Hybridisatie (ISH, FISH)
Single copy gene FISH
#18q, probes centro- and telomeric SYT gene
Chromosome copy number determination
# 1 centromere probe CISH
RNA-ISH Seminal Vesicle Secreted Protein 2
35S-probe
Dig-probe
In Situ Hybridisatie (ISH):
*
Vorm van “affiniteits cyto/histochemie”:
Target
Probe
DNA
DNA
DNA
RNA
RNA
DNA
RNA
RNA
In Situ Hybridisatie (ISH):
Vorm van “affiniteits cyto/histochemie”:
*
Weefselcoupe (vries of routine paraffine)
*
Weefsel toegankelijk maken (paraffine: digestie)
*
Denaturatie van de in situ target (enkelstrengs
maken)
*
Enkelstrengs probe(s) toevoegen
*
Incuberen (hybridiseren)
*
Wassen, interactie zichtbaar maken (vgl IHC)
In Situ Hybridisatie (ISH):
Vorm van “affiniteits cyto/histochemie”:
*
Interactie van probe met target DNA of RNA
zichtbaar maken (vgl IHC)
-
Fluorescent label: FISH
(FITC, TRITC, SpectrumGreen,
SpectrumOrange Texas red etc)
-
Chromogeen: CISH (PO, AP, Silver)
In Situ Hybridisatie (ISH):
FISH
CISH
Morfologie
-
+
Overlappende kernen
-
+
Out of focus
-
+
Autofluorescentie
-
+
Evaluatietijd
-
+
Houdbaarheid
-
+
Speciale microscoop
-
+
Gevoeligheid
+
-
Multiple probes
+
-
In Situ Hybridisatie (ISH):
Toepassing in de routine pathologie diagnostiek
*
Virus detectie (DNA of RNA)
*
Numerieke chromosomale afwijkingen
*
Chromosomale translocaties (lymfomen en
sarcomen)
*
Gen-amplificatie/deleties
In Situ Hybridisatie (ISH):
Toepassing in de routine pathologie diagnostiek
*
Virus detectie (DNA of RNA)
EBV RNA ISH “EBER”
In Situ Hybridisatie (ISH):
Toepassing in de routine pathologie diagnostiek
*
Numerieke chromosomale afwijkingen
- Mola diagnostiek (triploidie)
- weefselverwisseling
- Blaaskanker (recurrence) Urovision: p16 probe
en chromosoom 3, 7 en 17
Chromosome copy number determination
Complete mola, # 1 ISH
Chromosome copy number determination
Partial mola, # 1 ISH
In Situ Hybridisatie (ISH):
Toepassing in de routine pathologie diagnostiek
*
Chromosomale translocaties
-
Lymfomen:
Burkitt (like):
t(14;18)
Diffuse large B-cell:
t(8;14), t(14;18)
Folliculair:
t(14;18)
Mantel cell:
t(11;14)
MALT:
t(11;18)
In Situ Hybridisatie (ISH):
Toepassing in de routine pathologie diagnostiek
*
Chromosomale translocaties
- Sarcomen:
Synoviosarcoma:
t(X;18)
Alveolair Rhabdomyo: t(2;13), t(1;13)
Ewing’s/PNET:
t(11;22), t(21;22), t(7;22)
t(17;22), t(2;22)
Myxoid liposarcoom:
t(12;16), t(12;22)
Dual-fusion probes
Beide fusiepartners bekend
a
Dual-fusion probes
1 fusiepartner (breuk) bekend
Dual color break-apart probes
1 fusiepartner (breuk) bekend
Chromosome translocation (break)
FKHR Break Apart Probe
13q14 Region
Telomere
Centromere
FKHR
3’
~720 kb
ELF1
5’
~650 kb
RH45465
RH26447
D13S320
RH93960
RH98592
SHGC-79327
SHGC-142993
13q14 region
Dual Color Break Apart
FKHR
Normal
Abnormal
In Situ Hybridisatie (ISH):
Toepassing in de routine pathologie diagnostiek
*
Gen-amplificatie
- Her2/neu (17q11), mamma
- EGFR (7p12), long
- C-MYC (8q24), prostaat
*
Deleties
- PTEN (10q23), gliomen
- 1p36/19q13, gliomen
- P16 (9p21), blaas
In Situ Hybridisatie (ISH) in de
routine pathologie diagnostiek:
Succes van Her2 FISH en CISH:
- procedure robuust
- detectie amplificatie
- kit format
- klinische impact
- incidentie
ISH in de pathologie diagnostiek:
Problemen:
- over/onder digestie (fixatie)
- weefselarchitectuur
- interpretatie (vals pos/neg), getrunceerde kernen
(deleties), break-aparts
- genoom van kanker cel (zeer) complex
CONTROLES: procedure, neg/pos, binnen zelfde coupe,
externe QC (werkgroep rondzendingen,
SKKP)
In Situ Hybridisatie (ISH) in de
routine pathologie diagnostiek:
Toekomst:
- betere toegangkelijkheid paraffine
- meer kits
- multicolor combinatie IF-FISH
- multiple targets (Urovision)
- meer translocaties (carcinomen)
- automatisering (procedure en evaluatie)