DNA practicum – De modellenwereld van DNA

DNA practicum – De modellenwereld van DNA
Inleiding
Alle eigenschappen van een plant, zoals de grootte, de vorm van het blad, en de
enzymen die nodig zijn voor de fotosynthese, liggen opgeslagen in het DNA. Het
stukje DNA dat codeert voor één van deze eigenschappen, noemen we een gen.
Een plant bezit al snel 30 000 verschillende genen. En het is van groot belang
voor de landbouw om te weten voor welke eigenschappen deze 30 000 genen
coderen. Zo kunnen we met deze kennis bijvoorbeeld, tomatenplanten groeien
die grotere tomaten produceren, of maïs kweken die beter bestand is tegen
droogte.
In de Moleculaire biologie, probeert men de functie van
genen/eiwitten te achterhalen. Daarvoor worden modelsoorten gebruikt. Eén daarvan is Arabidopsis (fig. 1), een
onkruid dat snel groeit en een klein genoom heeft. Het hele
genoom (de DNA-sequentie) van Arabidopsis is intussen
bekend. We weten dus hoe de genen eruit zien, maar weten
nog niet van al deze genen wat ze doen. Met behulp van de
Fig. 1Arabidopsis thaliana
DNA-sequentie van genen uit Arabidopsis is het mogelijk om
vergelijkbare genen in andere plantensoorten te vinden, bv.
in tomaat. Sommige van deze genen zijn wat betreft DNA-
sequentie bijna niet veranderd, maar hebben wel een andere functie gekregen in
de loop van de evolutie.
Eén van de genen in Arabidopsis is ARF9, dat codeert voor een
transcriptiefactor, eiwitten die specifiek genen aan en/of uit kunnen zetten in
verschillende
soorten
cellen,
afhankelijk
van
de
situatie.
De
meeste
plantensoorten groeien naar boven, tegen de zwaartekracht in. Wanneer een
plant plat wordt neergelegd, wordt dat gedetecteerd door de plant en worden
1
bepaalde “groei-genen” aangeschakeld om weer naar boven te groeien. ARF9
speelt een belangrijke rol in dit proces.
Doel van het practicum
Mogelijk speelt ARF9 in tomaat ook een rol in de groei
van de plant. De tomaat (fig. 2) is een van de
belangrijkste gewassen. Alleen al binnen Europa
bedraagt de productie meer dan 21 miljard kilo per jaar.
Dus daarom zijn we altijd op zoek naar genen die de
productie van tomaten kunnen bevorderen. Misschien
is ARF9 daar een van. Maar om dat te onderzoeken
moeten we eerst controleren of ARF9 wel in tomaat
Fig. 2- Tomaat
zit. In dit practicum gaan we op zoek naar ARF9 in tomaat.
Dat gaan we doen m.b.v de volgende technieken:
-
DNA isolatie
-
PCR (polymerase chain reaction)
-
Gel electroforese
-
Bioinformatica
2
Maar eerst…pipetteren
Moleculair
biologen
werken
met
veel
verschillende
vloeistoffen,
zoals
oplossingen van zouten, buffers en enzymen. Maar de hoeveelheden zijn
ontzettend klein. De volumes worden dan ook aangegeven in milliliters (ml;
1/1000 liter) of microliters (μl; 1/1000 000 liter). Met behulp van een pipet kunnen
deze volumes nauwkeurig worden afgemeten.
De pipet werkt als volgt:

Kies de pipet die bij het te pipetteren volume past

Draai de pipet op het juiste volume

Zet een plastic pipetpunt op de pipet (houd deze pipetpunten alleen aan
het brede deel vast, zodat reacties niet besmet worden!)

Druk de pipet met de duim in tot de “eerste weerstand”

Zet de punt in de vloeistof en laat de duim rustig omhoog komen, zodat de
vloeistof wordt opgezogen (niet te snel!)

Pipetteer de vloeistof in een reageerbuisje door de pipet weer in te
drukken tot de “tweede weerstand”
Opdracht
Pipetteer de volgende volumes water samen in één reageerbuisje:
1.
o
1,00 ml
o
450 μl
o
200 μl
o
2x 20 μl
o
1x 10 μl
Wat is het totaal volume water in het reageerbuisje?
(geef het antwoord in ml en in μl)
2.
Wat zou het gewicht van het water in het reageerbuisje moeten zijn?
Weeg nu je reageerbuisje en controleer of je juist hebt gepipetteerd.
3
DNA-isolatie
Om te controleren of ARF9 ook in tomaat zit, gaan we eerst het DNA van de
tomaat isoleren. Dat doen we m.b.v. de “Edwards”- methode, een snelle
methode om een grote hoeveelheid DNA uit blad te isoleren.
Protocol DNA-Isolatie Edwards-methode
(K. Edwards et al., 1991, Nucleid Acids Research)
1-
Pak een klein stukje blad door deze “uit te ponsen”. Dit doe je door een stukje blad
tussen het epje (dit is plastic reactievaatje) en de dop te houden en de dop dicht te
drukken.
2-
Vermaal het stukje blad tot prut met behulp van een pesteltje (dit is een plastic
staafje waarmee blad wordt fijn gestampt).
3-
Voeg met de pipet 0,4 ml extractiebuffer toe. Deze buffer zorgt ervoor dat de
celwanden/membranen kapot gaan het dat het DNA vrijkomt. Het DNA lost
vervolgens op in de extractiebuffer.
4-
10 seconden goed schudden.
5-
Centrifugeer 1 minuut bij 13 000 rpm . Door het centrifugeren komen de celresten op
de bodem te liggen. Het DNA blijft opgelost in de extractiebuffer en zit dus in de
bovenste laag.
6-
Zuig met een pipet 0,3 ml van de extractiebuffer (bovenste laag) voorzichtig op en
pipetteer de vloeistof in een nieuw epje. Let op dat je de celresten op de bodem laat
liggen (afval).
7-
Voeg met de pipet 0,3 ml isopropanol toe aan het nieuwe epje (met daarin de
bovenste laag) en meng voorzichtig door het epje een paar keer om te keren, niet
schudden! DNA lost niet op in isopropanol en zal dus gaan neerslaan.
8-
Centrifugeer 5 minuten bij 13 000 rpm. Het neergeslagen DNA komt nu op de bodem
te liggen.
9-
Zuig met de pipet de vloeisof af (afval). Let erop dat het neergeslagen DNA op de
bodem van het epje blijft liggen.
10-
Centrifugeer 1 minuut bij 13 000 rpm en zuig het laatste restje vloeistof af (afval).
11-
Laat het epje 5 minuten staan met de deksel open zodat de laatste resten
isopropanol verdampen.
12-
Voeg 0,2 ml water aan het DNA toe en pipetteer een paar keer op en neer om het
DNA goed op te lossen.
4
PCR
Vervolgens gaan we testen of ARF9 in het geïsoleerde DNA van tomaat zit. Dat
wordt gedaan m.b.v. de polymerase kettingsreactie, afgekort PCR (Polymerase
Chain Reaction). Wanneer ARF9 in het DNA van tomaat zit, wordt deze met de
PCR vele malen gekopieerd zodat we deze
zichtbaar kunnen maken op een gel. De
PCR-reactie
bestaat
uit
de
volgende
componenten:

het geïsoleerde DNA,

Taq DNA polymerase,

losse basen (A, T, G of C) en

primers
Fig. 3- Taq DNA polymerase plakt de
basen aan elkaar zodat ze op de
bestaande streng DNA passen.
De PCR maakt gebruik van het enzym Taq DNA polymerase, die losse basen
aan elkaar plakt. De twee strengen van het geïsoleerde DNA worden uit elkaar
gehaald door de temperatuur te verhogen, waardoor twee enkele strengen DNA
overblijven. De Taq gebruikt deze enkele strengen als matrijs, of mal, voor het
maken van een nieuwe streng DNA. De Taq beweegt over de enkele DNA streng
en leest deze af. Bij iedere “T” die de Taq tegenkomt, plakt deze een “A” vast, en
bij ieder “C” een “G”, enzovoorts. Zo ontstaat opnieuw een dubbele streng DNA
(fig. 3).
Om het DNA dubbelstrengs te maken, heeft de Taq al een klein stukje
dubbelstrengs DNA nodig als startpositie. Daarvoor dienen de primers. Dit zijn
kleine stukjes DNA, die zo gemaakt zijn dat zij overeenkomen met de DNAsequentie van de ARF9 uit Arabidopsis. Omdat zij alleen op ARF9 passen, is de
ARF9 het enige stuk DNA dat uit het gehele genoom van de plant wordt
vermeerderd.
5
De PCR reactie bestaat uit drie fasen (fig. 4):
-
Denaturatie: door de temperatuur
tot 94 ۫C te verhogen splitsen de
twee DNA ketens uit elkaar.
-
Hybridisatie:
bij
een
lagere
temperatuur, 55 ۫C, binden de
primers op het geïsoleerde DNA,
maar alleen op de basen van de
GGO-marker.
-
Extensie: de temperatuur wordt
verhoogd
tot
72
۫C.
Bij
deze
temperatuur begint de Taq vanuit
de primers, een kopie te maken
Fig. 4- Polymerase kettingreactie
van de ARF9 uit het geïsoleerde
DNA. De Taq plakt de losse nucleotiden (dNTPs) aan elkaar en gebruikt
daarbij dus één van de ketens als voorbeeld om te zien in welke volgorde
de basen aan elkaar geplakt moeten worden.
De kopieën kunnen op hun beurt ook weer worden gekopieerd, dus na iedere
stap is er dus twee maal zoveel van het gewenste DNA als ervoor. Door deze
stappen een aantal malen te herhalen, bijvoorbeeld 35 of 40 keer (cycli), krijgt
men een enorme hoeveelheid DNA.
http://www.bioplek.org/animaties/moleculaire_genetica/PCR.html
6
Protocol PCR
1-
Pipetteer 5 μl DNA-oplossing in een PCR-buisje.
2-
Maak een mix voor de PCR-reactie klaar in een epje:
3-
Water
11 μl
10x PCR buffer
2,5 μl
25 mM MgCl2
2,5 μl
10mM dNTPs
1
μl
Forward primer
1
μl
Reverse primer
1
μl
Taq polymerase
1
μl
Totaal
20 μl
Pipetteer de mix bij de 5 μl DNA-oplossing en pipetteer een paar keer op en neer om
te mengen.
4-
Verzamel alle PCR-buisjes op ijs zodat alle buisjes tegelijk in het PCR-apparaat
kunnen.
5-
PCR-programma:
94 ۫C
2 min.
94 ۫C
20 sec.
55 ۫C
20 sec.
72 ۫C
1 min.
15 ۫C
∞
35x
7
Gel Electroforese
Grote hoeveelheden DNA kunnen we op een gel zichtbaar maken m.b.v. gel
elektroforese. Gel elektroforese is een scheidingstechniek die moleculen onder
invloed van een elektrisch veld laat bewegen in een gel. Negatief geladen
moleculen bewegen naar beneden waar de positieve pool zich bevindt. DNA
moleculen hebben een negatieve lading. Hoe groter de moleculen, hoe trager ze
door de gel kunnen bewegen; hoe kleiner de moleculen, hoe sneller ze zullen
bewegen. Gel elektroforese kan dus ook worden gebruikt voor het scheiden en
analyseren van DNA-fragmenten, die ontstaan na een PCR reactie.
Naast de PCR-reactie zetten we ook een DNA-ladder op gel. Deze
DNA-ladder is een mengsel van DNA-fragmenten met bekende
grootte. Door de hoogte van het PCR-product te vergelijken met de
fragmenten van de DNA-ladder, kunnen we vaststellen hoe groot het
PCR-product is (fig. 5).
Fig. 5DNA-ladder
Protocol Gel electroforese
1- Meng 8 μl PCR-product met 2 μl Loading buffer. Deze buffer verzwaart het DNA,
daardoor is het PCR-product makkelijker in de gel te pipetteren.
2- Pipetteer de 10 μl in de gel.
3- Pipetteer 3 μl DNA-ladder in de gel.
4- Laat de gel ongeveer 10 min. lopen.
5- Haal de gel uit de electroforese-bak en leg deze 2-3 minuten in 100x Fast Blast DNA
stain.
6- Giet na 2-3 minuten de kleuring af, en spoel de gel met warm kraanwater.
7- Laat de gel 2 X 5 minuten met warm kraanwater staan, na de 2de wasbeurt worden de
DNA-fragmenten zichtbaar. Het kan 5-15 minuten duren voordat deze scherp zijn.
Hoe groot is het PCR-product?
8
Bioinformatica
In de moleculaire biologie wordt veel gebruik gemaakt van
de genbank. De genbank is een database op het internet
waar alle genen van mensen, dieren, planten en microorganismen op staan waarvan de DNA-sequentie bekend
is. Is de functie van het gen bekend, wordt deze erbij
vermeld.
Het PCR-product is uit het DNA van tomaat gekopieerd. Na het sequensen
(vaststellen van de DNA-sequentie), blijkt dit product er als volgt uit te zien:
GGTCAAGGGA CTAATCAGCC GATTGTTATT CCTACTGATG GGAGAAAATG TGATACCA
AAAAAACCTG TAGATTATTT GGTATTGACT TGAAAAGTCC CTCAATTAGC ACTACTGAGG
CACGACTACA GCTACAGCCA GCCGGCATTT CTTGTGTCTT TGCAGAGAGA GCACCTCCAA
ACACGGTGCC TGCTGGTGAT TCAGATCAAA AGTCTGAGCT TGGCAGTAGA CTTCAAAG
ATCAAATGCA AGGCCATTTG CGGTTACCCC TAAAGGAGGT TCAAAGCAAG CAGAGTTGTT
CCACCAGGTC TCGCACAAAG GTGCAAATGC AAGGCGTAGC TGTAGGCCGT GCAGTGGATT
TAACCATATT GAAAGGATAC GATGAGCTTA CAAAGGAGCT TGAGGAGATG TTTGAAATCC
AAGGAGAGCT TCAGTCACGA CAGAAATGGG GGATCTTGTT TACAGATGAT GAAGGGGATA
CAATGCTTAT GGGTGA
Op basis van deze sequentie kunnen we een paar vragen stellen:

Bovenstaande sequentie is maar een klein stuk van het totale gen. Is er
misschien al meer DNA-sequentie bekend van ARF9 uit tomaat?

Is dit de ARF9 uit tomaat?
Deze vragen kunnen we beantwoorden met behulp van de genbank.
Opdracht
Vraag 1: is er meer DNA-sequentie bekend van ARF9 uit tomaat?
1. Ga naar de website van de genbank: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/. Klik op BLAST, en
vervolgens onder “Basic BLAST” op “nucleotide blast”.
9
2. Plak in het witte vlak onder “Enter Query sequence” de DNA-sequentie van het PCRproduct.
3. Zet de “Choose search set” op Others, we willen namelijk niet zoeken in de database van
mens of muis.
4. Klik vervolgens op “BLAST”.
5. Onder “Descriptions” komt nu een lijst te staan met genbank sequenties die
overeenkomen met de DNA-sequentie van het PCR-product. De “query coverage” geeft
aan welk percentage van het PCR-product overeenkomt met de genbank sequentie
(subject). Daarnaast is ook de “E-value” belangrijk. Deze waarde geeft aan hoe sterk de
sequenties van PCR-product en genbank op elkaar lijken, en moet dus zo dicht mogelijk
bij nul zitten. Onder “Alignments” wordt het vergelijk in meer detail weergegeven.
6. Klik op de code onder “Accession” en beantwoord de volgende vragen:

Uit welk organisme komt deze DNA sequentie?

Hoe groot is deze genbank sequentie, en is deze groter dan het PCR-product?
Vraag 2: Is dit de ARF9 uit tomaat?
1. Ga terug naar de “nucleotide blast” en plak de sequentie van het PCR-product in Ënter
Query sequence”.
2. Zet de “Choose search set” op “Others”, en vul bij “organisms” het organisme
“arabidopsis thaliana” in. We gaan nu het PCR-product vergelijken met alle DNAsequenties van Arabidopsis.
3. Vink onder “program selection” “somewhat similar sequences” aan.
4. Klik vervolgens op “BLAST”.
5. Klik nu onder “Descriptions” op “query coverage” zodat de genbank sequenties met de
hoogste coverage bovenaan komen te staan en beantwoord de volgende vraag:

Is het PCR-product de ARF9 uit tomaat?
10