Titel presentatie Subtitel
advertisement
HLA typeringen: nieuwe DNA technieken Wendy T.N. Swelsen Afdeling Immunogenetica, HLA diagnostiek |1 Structuur presentatie • DNA typeerstraat • Nieuwe techniek: Next Generation Sequencing (NGS) |2 Afdeling Immunogenetica, HLA • Hematopoïetische stamceltransplantatie • Solid organ transplantatie • Transfusie problematiek • Ziekte associaties • Populatie studies / research doeleinden |3 HLA complex 1 2 HLA klasse I HLA-A HLA-B HLA-C HLA klasse II HLA-DR HLA-DQ HLA-DP |4 HLA typeren • Serologische technieken detectie HLA antigenen • DNA technieken detectie HLA allelen PCR-SSP spoedbepalingen (orgaandonatie, refractaire patiënten) PCR-SSO lage resolutie HLA typeringen (bijv. A*01) PCR-SBT hoge resolutie HLA typeringen (bijv. A*01:01) typeerstraat |5 Toename aantal HLA allelen |6 Efficiënt HLA typeren in ‘typeerstraat’ DNA isolatie/kwantificeer Experimate Chemagen Pre-PCR pipetteer robot Hybridisatie robot Xiril HLA Luminexhybridiseer GenProbe en Trinean unit 2D barcode opslag Middleware software CLIS ABI-3130xl sequencer Post- PCR pipetteerrobot Xiril Elektronisch te versturen uitslagen |7 Sample track and trace 2D barcode gelabelde tubes en 96 wells platen |8 DNA isolatie robot • Import werklijst van CLIS • DNA isolatie • Bloed • Wangslijm • Kwantificering • Normalisatie • Export resultaten naar CLIS |9 Pre-PCR robot • Import werklijst CLIS • Verschillende set-ups tegelijkertijd • Pipetteren bij 4°C en KT • Export werklijst naar • hybridiseer station (PCR-SSO) • post-PCR robot (PCR-SBT) Pre-PCR robot 4x96 reacties / run | 10 Luminex-hybridiseer station (PCR-SSO) • Import werklijst • Hybridisatie gelabelde PCR producten aan beads • Meting in Luminex apparaat Hybridiseer station 5x96 testen / run | 11 Post-PCR robot (PCR-SBT) • Import werklijst • Zuivering PCR producten • Set-up sequentie reacties • Zuivering sequentie producten • Export sample file naar sequencer Post-PCR robot 4x96 sequentie reacties / run | 12 Efficiënt HLA typeren in ‘typeerstraat’ DNA isolatie/kwantificeer Experimate Chemagen Pre-PCR pipetteer robot Hybridisatie robot Xiril HLA Luminexhybridiseer GenProbe en Trinean unit 2D barcode opslag Middleware software CLIS ABI-3130xl sequencer Post- PCR pipetteerrobot Xiril Elektronisch te versturen uitslagen | 13 Voordelen HLA typeerstraat • Continu kwaliteitsniveau • Geen monsterverwisseling • Geen schrijffouten • Geen pipetteerfouten • Minder hands-on time | 14 Nieuwe technieken Nieuwe technieken • Registry typing SSO SBT sanger, batch-wise • Kostenbesparing • Intermediate resolutie typeer niveau • Patiënt en stamceldonor typering SBT sanger SBT next-generation sequencing | 16 Next generation sequencing Methode om heel veel verschillende genen tegelijkertijd te sequencen, waarbij materialen van verschillende patiënten gepooled kunnen worden. | 17 NGS: oplossing HLA typeer probleem? Toename aantal HLA allelen meer ambiguïteiten | 18 Genomische organisatie HLA Chromosoom 6 DPB1 DPB1 DQB1 DRB1 DQB1 DRB1 B C A B C A HLA-A gen 1 2 3 4 5 HLA-A gen 67 8 1 2 3 4 5 67 8 | 19 Ambiguïteiten bij Sanger sequencing (1) Allel combinatie 1 Allel combinatie 2 A*01:01:01:01 & A*11:01:01 A*01:19 & A*11*19 Geen phasing vervolgonderzoek nodig | 20 Ambiguïteiten bij Sanger sequencing (2) Typering DRB1*03:01 + DRB1*12:01 / *12:10 Niet gekarakteriseerde DRB1 regio exon 1 | 21 Karakteristieken NGS (1) Clonale amplificatie • Emulsie PCR • Bridge PCR Voordeel: direct allel-specifieke typering (geen phase ambiguïteiten) | 22 Karakteristieken NGS (2) Uitgebreide parallelle sequencing Voordeel: sequencen additionele exonen en intronen | 23 Vier NGS platforms Roche 454 GS FLX, GS Junior Life technologies IonTorrent PGM Illumina’s Miseq Pac Biosciences SMRT | 24 Hoge resolutie HLA typering & NGS • HLA typering in 1 run • Analyse van grote genomische regio’s • Gelijktijdige analyse van veel monsters • Kostenbesparing indien voldoende schaalgrootte | 25 Acknowledgements Afdeling Immunogenetica • Masja de Haas • Junior Lardy • Peter van Eede • Miranda van de Weerd Moleculair platform • Ellen van der Schoot • Richard van Hien | 26 Deze dia alléén voor grote grafische uitingen gebruiken (vergeet niet deze textbox te verwijderen)