GGO ontsnapt?!

GGO ontsnapt?!
Practicum opdracht
Bezoek FNWI afdeling : Celbiologie van de Plant, Biologie
Wat is een GGO?
Alle eigenschappen van een plant, zoals de grootte,
de vorm van het blad, en de enzymen die nodig zijn
voor de fotosynthese, liggen opgeslagen in het DNA.
Het stukje DNA dat codeert voor één van deze
eigenschappen, noemen we een gen. Een plant bezit
al snel zo’n 30 000 verschillende genen. En het is van
groot belang voor de landbouw om te weten voor
welke eigenschappen deze 30 000 genen coderen.
Figuur 1Genetische modificatie.
Zo kunnen we met deze kennis bijvoorbeeld,
tomatenplanten
groeien
die
grotere
tomaten
produceren, of maïs kweken die beter bestand is
tegen droogte.
Een manier om de functie van een gen te achterhalen, is door deze uit te
schakelen. Door te kijken wat er vervolgens in de plant verandert, krijg je een
idee wat de mogelijke functie van het gen zou kunnen zijn. Met de uitschakeling
van een gen, wordt dus het genoom van de plant veranderd. Deze plant is dus
een genetisch gemodificeerd organisme (GGO). In de kassen van de universiteit
1
mogen we genetisch gemodificeerde planten alleen opkweken als we voldoen
aan strenge regels, want een GGO mag natuurlijk niet uit de kassen ontsnappen.
Hoe kan een GGO ontsnappen?
De voortplanting van zaadplanten is
afhankelijk van wind en insecten, die
ervoor zorgen dat het stuifmeel vanuit
de
helmknop
(het
mannelijk
voortplantingsorgaan) wordt verspreid.
Wanneer een stuifmeelkorrel op de
stempel van een bloem van dezelfde
soort
terecht
komt,
vormt
Figuur 2- Schematische bouw van een bloem.
de
stuifmeelkorrel een buis door de stijl tot aan een van de zaadknoppen in het
vruchtbeginsel (het vrouwelijk voortplantingsorgaan). In de zaadknop versmelt
een kern van de stuifmeelbuis met die van de eicel, die zich vervolgens gaat
ontwikkelen tot een kiemplantje. Tegelijkertijd ontwikkelt het vruchtbeginsel zich
tot een vrucht.
Wanneer genetisch gemodificeerde planten op het land worden verbouwd,
bestaat de kans dat de stuifmeelkorrels van deze planten via de wind of met
behulp van insecten, op de stempel terecht komen van niet-gemodificeerde
soortgenoten. Het risico van verspreiding in de natuur of naar nietgemodificeerde landbouwgewassen in de buurt is dan ook een van de grootste
bezwaren tegen het opkweken en op grote schaal verbouwen van genetisch
gemodificeerde
planten.
Dankzij
hun
stuifmeelkorrels
kunnen
genetisch
gemodificeerde planten dus makkelijk aan de controle van de mens ontsnappen.
Om het risico van verspreiding in te kunnen schatten, moeten we genetisch
gemodificeerde planten makkelijk kunnen herkennen.
2
Hoe kunnen we GGO’s herkenbaar maken?
Dat kan met behulp van een marker die is ingebouwd in het DNA van de GGO’s.
Een marker, in het Engels vaak “selectable marker” genoemd, maakt het
mogelijk om genetisch gemodificeerde planten te selecteren uit een groep wel en
niet gemodificeerde planten. Deze marker is meestal een antibioticumresistentie,
zoals de resistentie tegen het antibioticum kanamycine. Door planten op te
kweken op een medium waar kanamycine in zit, overleven alleen die planten die
resistent zijn, en die dus succesvol zijn gemodificeerd.
Om de aanwezigheid van de GGO-marker aan te tonen, moeten we eerst het
DNA uit de plant isoleren. Vervolgens wordt de GGO-marker vanuit het
geïsoleerde DNA worden vermeerderd zodat we deze zichtbaar kunnen maken
op een gel.
3
Het practicum bestaat uit vier onderdelen:
1-
Jullie gaan m.b.v. een biochemisch experiment bij 4 planten uitzoeken
welke daarvan genetisch gemodificeerd zijn.
2-
Jullie
krijgen
d.m.v.
Cryo-FESEM
microscopie
stempels
en
stuifmeelkorrels te zien.
3-
Jullie krijgen d.m.v. fluorescentie microscopie te zien hoe stuifmeelkorrels
een buis vormen van de stempel tot aan de zaadknoppen.
4-
Tot slot moeten jullie nog een aantal opdrachten maken over de GGO’s
Opdracht 1 en 4 wordt in groepjes van twee uitgevoerd. Opdracht 2 en 3 zijn
demonstraties.
In totaal duurt het practicum: 3,5 - 4 uur
4
1-
Wel/geen GGO: uitzoeken welke van de 4 planten genetisch
gemodificeerd zijn.
Om de aanwezigheid van de GGO-marker, die in het genoom van de GGO is
ingebouwd, aan te tonen, moet eerst het DNA uit de plant worden geïsoleerd.
Het DNA is een groot molecuul, dat is
opgebouwd uit twee ketens die een dubbele
spiraal vormen, een soort wenteltrap (fig. 3).
De basen A, T, G en C vormen de treden van
deze trap, en de volgorde van deze basen
bepaalt de erfelijke informatie die in het DNAmolecuul is vastgelegd. De twee ketens van
het DNA-molecuul zijn met elkaar verbonden
door basenparen. Tegenover de T in de ene
keten zit altijd een A in de andere keten;
Figuur 3- Opbouw van DNA.
evenzo vormen C en G een basenpaar.
Het DNA gaan we isoleren m.b.v. de “Edwards”- methode, een snelle methode
om een grote hoeveelheid DNA uit blad te isoleren. Vervolgens moet de GGOmarker vanuit het geïsoleerde DNA worden vermeerderd zodat we deze
zichtbaar kunnen maken op een gel. De marker wordt vele malen gekopieerd
m.b.v. de polymerase kettingsreactie, afgekort PCR (Polymerase Chain
Reaction).
De
reactie
bestaat
uit
de
volgende componenten:

het geïsoleerde DNA,

Taq DNA polymerase,

losse basen (A, T, G of C) en

primers
Figuur 4- Taq DNA polymerase plakt de
basen aan elkaar zodat ze op de
bestaande streng DNA passen.
5
De PCR maakt gebruik van het enzym Taq DNA polymerase, die losse basen
aan elkaar plakt. De twee strengen van het geïsoleerde DNA worden uit elkaar
gehaald door de temperatuur te verhogen, waardoor twee enkele strengen DNA
overblijven. De Taq gebruikt deze enkele strengen als matrijs, of mal, voor het
maken van een nieuwe streng DNA. De Taq beweegt over de enkele DNA streng
en leest deze af. Bij iedere “T” die de Taq tegenkomt, plakt deze een “A” vast, en
bij ieder “C” een “G”, enzovoorts. Zo ontstaat opnieuw een dubbele streng DNA
(fig. 4).
Om het DNA dubbelstrengs te maken, heeft de Taq al een klein stukje
dubbelstrengs DNA nodig als startpositie. Daarvoor dienen de primers. Dit zijn
kleine stukjes DNA, die zo gemaakt zijn dat zij overeenkomen met de basenvolgorde van de GGO-marker. Omdat zij alleen op de GGO-marker passen, is de
GGO-marker het enige stuk DNA dat uit het gehele genoom van de plant wordt
vermeerderd. Wanneer een plant dus niet genetisch gemodificeerd is, zal er
geen DNA worden vermeerderd.
De PCR reactie bestaat uit drie fasen (fig. 5):
-
Denaturatie: door de temperatuur
tot 94 ۫C te verhogen splitsen de
twee DNA ketens uit elkaar.
-
Hybridisatie:
bij
een
lagere
temperatuur, 55 ۫C, binden de
primers op het geïsoleerde DNA,
maar alleen op de basen van de
GGO-marker.
-
Extensie: de temperatuur wordt
verhoogd
tot
72
۫C.
Bij
deze
temperatuur begint de Taq vanuit
de primers, een kopie te maken
van
de
GGO-marker
uit
Figuur 5- Polymerase kettingreactie
het
6
geïsoleerde DNA. De Taq plakt de losse nucleotiden (dNTPs) aan elkaar
en gebruikt daarbij dus één van de ketens als voorbeeld om te zien in
welke volgorde de basen aan elkaar geplakt moeten worden.
De kopieën kunnen op hun beurt ook weer worden gekopieerd, dus na iedere
stap is er dus twee maal zoveel van het gewenste DNA als ervoor. Door deze
stappen een aantal malen te herhalen, bijvoorbeeld 35 of 40 keer (cycli), krijgt
men een enorme hoeveelheid DNA.
http://www.bioplek.org/animaties/moleculaire_genetica/PCR.html
Grote hoeveelheden DNA kunnen we op een gel zichtbaar maken m.b.v. gel
elektroforese. Gel elektroforese is een scheidingstechniek die moleculen onder
invloed van een elektrisch veld laat bewegen in een gel. Negatief geladen
moleculen bewegen naar beneden waar de positieve pool zich bevindt. DNA
moleculen hebben een negatieve lading. Hoe groter de moleculen, hoe trager ze
door de gel kunnen bewegen; hoe kleiner de moleculen, hoe sneller ze zullen
bewegen. Gel elektroforese kan dus ook worden gebruikt voor het scheiden en
analyseren van DNA-fragmenten, die ontstaan na een PCR reactie. In deze PCR
reactie, geven alleen planten die genetisch gemodificeerd zijn een PCR-product
(fig. 6A).
A
B
Figuur 6- Gel met daarop genetisch gemodificeerde planten (2, 4 en 5) en niet gemodificeerde
planten (1, 3 en 6). De grootte van de GGO marker (700 bp) is vast te stellen m.b.v. de DNA ladder,
links op de gel (A). In de schematische weergave van de DNA ladder (B) is te zien hoe groot alle
fragmenten zijn.
7
Maar we moeten wel zeker weten dat de Taq het juiste DNA heeft gekopieerd,
dat controleren we door de grootte van het PCR-product vast te stellen. Daarom
brengen we niet alleen de PCR-reactie op gel, maar ook een DNA-ladder. Deze
DNA-ladder is een mengsel van DNA-fragmenten met bekende grootte. Door de
hoogte van het PCR-product te vergelijken met de fragmenten van de DNAladder, kunnen we vaststellen hoe groot het PCR-product is, en controleren of
dat overeenkomt met de grootte van de GGO-marker (fig. 6B).
8
Voorschrift DNA-Isolatie Edwards-methode
(K. Edwards et al., 1991, Nucleid Acids Research)
1-
Pak een klein stukje blad door deze “uit te ponsen”. Dit doe je door een stukje blad
tussen het epje (dit is plastic reactievaatje) en de dop te houden en de dop dicht te
drukken.
2-
Vermaal het stukje blad tot prut met behulp van een pesteltje (dit is een plastic
staafje waarmee blad wordt fijn gestampt).
3-
Voeg met de pipet 0,4 ml extractiebuffer toe. Deze buffer zorgt ervoor dat de
celwanden/membranen kapot gaan het dat het DNA vrijkomt. Het DNA lost
vervolgens op in de extractiebuffer.
4-
10 seconden goed schudden.
5-
Centrifugeer 1 minuut bij 13 000 rpm . Door het centrifugeren komen de celresten op
de bodem te liggen. Het DNA blijft opgelost in de extractiebuffer en zit dus in de
bovenste laag.
6-
Zuig met een pipet 0,3 ml van de extractiebuffer (bovenste laag) voorzichtig op en
pipetteer de vloeistof in een nieuw epje. Let op dat je de celresten op de bodem laat
liggen (afval).
7-
Voeg met de pipet 0,3 ml isopropanol toe aan de extractiebuffer en meng voorzichtig
door het epje een paar keer om te keren (niet schudden!). DNA lost niet op in
isopropanol en zal dus gaan neerslaan).
8-
Laat het epje 2 minuten staan.
9-
Centrifugeer 5 minuten bij 13 000 rpm. Het neergeslagen DNA komt nu op de bodem
te liggen.
10-
Zuig met de pipet de vloeisof af (afval). Let erop dat het neergeslagen DNA op de
bodem van het epje blijft liggen.
11-
Centrifugeer 1 minuut bij 13 000 rpm en zuig het laatste restje vloeistof af (afval).
12-
Laat het epje 5 minuten staan met de deksel open zodat de laatste resten
isopropanol verdampen.
13-
Voeg 0,2 ml water aan het DNA toe en pipetteer een paar keer op en neer om het
DNA goed op te lossen.
9
Voorschrift PCR van de GGO marker
1-
Pipetteer 5 μl DNA-oplossing in een PCR-buisje.
2-
Maak een mix voor de PCR-reactie klaar in een epje:
3-
Water
11 μl
10x PCR buffer
2,5 μl
25 mM MgCl2
2,5 μl
10mM dNTPs
1
μl
Forward primer
1
μl
Reverse primer
1
μl
Taq polymerase
1
μl
Totaal
20 μl
Pipetteer de mix bij de 5 μl DNA-oplossing en pipetteer een paar keer op en neer om
te mengen.
4-
Verzamel alle PCR-buisjes op ijs zodat alle buisjes tegelijk in het PCR-apparaat
kunnen.
5-
6-
PCR-programma:
94 ۫C
2 min.
94 ۫C
20 sec.
55 ۫C
20 sec.
72 ۫C
30 sec.
15 ۫C
∞
35x
Meng 8 μl PCR-product met 2 μl Loading buffer. Deze buffer verzwaart het DNA,
daardoor is het PCR-product makkelijker in de gel te pipetteren.
6-
Pipetteer de 10 μl in de gel.
7-
Pipetteer 3 μl DNA-ladder in de gel
8-
Laat de gel ongeveer 10 min. lopen.
9-
De practicumassistent gaat nu een foto van de gel maken.
10-
Bij welke planten heb je een PCR-product en bij welke niet? (planten met PCRproduct zijn GGO’s, planten die geen PCR-product hebben opgeleverd zijn niet
gemodificeerd)
11-
Klopt de grootte van het PCR-product, met de grootte van de GGO-marker (700
basen)?
12-
Dan weet je nu welke planten GGO’s zijn en welke niet!
10
2-
Bekijken van de stempel en stuifmeelkorrels m.b.v. CryoFESEM microscopie.
Stuifmeelkorrels kunnen door hun bouw gemakkelijk worden verspreid door wind,
water of insecten. Ze dragen vaak uitsteeksels of luchtblazen, waardoor een
bepaalde manier van verspreiding mogelijk gemaakt wordt. De vorm en structuur
van de buitenste laag zijn dan ook kenmerkend voor iedere plantensoort.
Tijdens het practicum gaan we stuifmeelkorrels van onder andere de lelie,
zandraket en pinus bekijken m.b.v. de Cryo-FESEM (Field-Emission Scanning
Electron Microscope). Met deze microscoop kan men kleine objecten tot zelfs 1
nanometer (een miljoenste millimeter) zichtbaar maken. Deze microscoop werkt
niet met licht maar met elektronen. De elektronen worden in een “bron”
vrijgemaakt
(Emissie)
en
versneld
onder
invloed
van
een
elektrisch
spanningsveld (Field). Deze bundel elektronen tast vervolgens het object af
(Scannen) en door interactie met de atomen aan het oppervlakte van het object
worden secundaire elektronen vrijgemaakt. De hoek en snelheid waarmee de
secundaire electronen vrijkomen zijn kenmerkend voor de oppervlakte structuur
van het object. Vervolgens worden de secundaire electronen door een detector
opgevangen en tot een electronisch signaal omgezet. Dit signaal wordt versterkt
en verwerkt tot een video scanbeeld dat op een monitor te zien is
(www.science.ru.nl/FNWI/GI/).
11
3-
Bekijken van stuifmeelkorrels, die een buis vormen van de
stempel
tot
aan
de
zaadknoppen
m.b.v.
fluorescentie
microscopie.
Een stuifmeelkorrel bestaat in principe uit
twee
cellen:
een
kleine
mannelijke
voortplantingcel (generatieve cel) omgeven
door een grote cel (“Tube cell”). Eenmaal op
Tube cell
Generative cell
de stempel geland, vormt de tube cell een
lange buis, die vanaf de stempel doorgroeit
door de stijl tot aan de zaadknop in het
vruchtbeginsel,
om
de
Figuur 7- Stuifmeelkorrel.
mannelijke
voortplantingscel naar de eicel te brengen.
Deze cel wordt dus enorm groot en langgerekt. Om niet teveel energie te
verliezen
bewegen
de
celkern,
het
cytoplasma
en
de
mannelijke
voortplantingscel mee naar beneden met de top van de buis en wordt op
regelmatige afstand van de top een soort plug ingebouwd van callose. Zo wordt
het actieve deel van de cel zo klein mogelijk gehouden.
Door een stijl te kleuren met de vloeistof aniline blauw, kan de callose zichtbaar
worden gemaakt onder invloed van fluorescentie. De microscoop die we
daarvoor gebruiken, maakt het mogelijk objecten in de ordegrootte van 1
micrometer (een duizendste millimeter) tot 5 mm te bestuderen.
12
4-
Opdrachten
DNA-isolatie
1-
De extractiebuffer bestaat bevat o.a. zeep, welke celonderdelen gaan
kapot door de zeep?
2-
De extractiebuffer bevat ook veel zouten, deze veranderen de
structuur van eiwitten. Wat doet zout met de chromosomen?
PCR
1-
De vermeerdering van het DNA volgt een wiskundig verband, welk
verband is dat?
2-
Hoeveel strengen DNA hebben we van het resistentie-gen na een
PCR reactie van 40 cycli?
Algemeen
1-
Welke maatregelen kun je bedenken om te voorkomen dat GGO’s uit
de kassen ontsnappen?
2-
Hoe ver stuifmeelkorrels zich versplaatsen is afhankelijk van de soort.
Kun je een experiment bedenken waarmee we het risico van
stuifmeelverspreiding kunnen testen?
13