optimalisatie van een methode voor tdm van β

UNIVERSITEIT GENT
FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN
Vakgroep Bioanalyse
Laboratorium voor Toxicologie
Academiejaar 2014-2015
OPTIMALISATIE VAN EEN METHODE VOOR TDM VAN
Β-LACTAM ANTIBIOTICA
Cyrielle VAN WEEHAEGHE
1e master in de geneesmiddelontwikkeling
Promotor
Prof. Dr. C. Stove
Commissarissen
Dr. D. Borrey
Dr. P. Colin
UNIVERSITEIT GENT
FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN
Vakgroep Bioanalyse
Laboratorium voor Toxicologie
Academiejaar 2014-2015
OPTIMALISATIE VAN EEN METHODE VOOR TDM VAN
Β-LACTAM ANTIBIOTICA
Cyrielle VAN WEEHAEGHE
1e master in de geneesmiddelontwikkeling
Promotor
Prof. Dr. C. Stove
Commissarissen
Dr. D. Borrey
Dr. P. Colin
Auteursrecht
“De auteur en de promotor geven de toelating deze masterproef voor consultatie
beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik
valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de
verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van de resultaten uit deze
masterproef.”
Samenvatting
In deze masterproef wordt een methode beschreven voor de kwantificatie van vijf βlactam antibiotica (meropenem, ceftazidim, cetriaxon, piperacilline en flucloxacilline) in
plasma of serum. Deze antibiotica worden toegediend aan patiënten met een sepsis op de
afdeling intensieve zorgen. Aangezien de concentratie van dit soort geneesmiddelen sterk
varieert bij ernstig zieke patiënten, is een individuele antibioticumtherapie noodzakelijk. De
onderstaande analyse is gevalideerd en kan in de toekomst gebruikt worden om na te gaan
of de toegediende dosis voldoende therapeutisch effect zal hebben bij een patiënt.
Het is noodzakelijk dat deze analyse goed aansluit bij testen die reeds uitgevoerd worden
in het AZ Sint-Jan te Brugge, opdat dit onderzoek in routine uitgevoerd zou kunnen worden.
De staalvoorbereiding voor deze methode bestaat uit een eenvoudige methanol precipitatie.
De scheiding gebeurt met behulp van hoge druk vloeistofchromatografie met gradiëntelutie.
De kolom die hiervoor gebruikt wordt is een Nucleodur® RP C18 Pyramid kolom (150 × 4,6
mm, 5 µm) en de mobiele fase bestaat uit een mengsel van fosfaatbuffer pH 3 en
acetonitrile. Als interne standaard wordt gebruik gemaakt van cefoperazone. De golflengte
waarbij het chromatogram wordt opgenomen is 300 nanometer voor meropenem, 240
nanometer voor piperacilline en flucloxacilline en 290 nanometer voor ceftazidim en
ceftriaxon.
Ook de bewaarcondities van de vijf antibiotica worden bepaald. Meropenem en
flucloxacilline breken binnen de vijf uur af, wanneer ze bewaard worden bij
kamertemperatuur, de andere onderzochte antibiotica zijn stabieler. Licht heeft geen
invloed op de stabiliteit van de β-lactam antibiotica.
Dankwoord
In de eerste plaats zou ik graag Prof. Dr. C. Stove willen bedanken voor de kans mijn
masterproef uit te voeren in het AZ Sint-Jan. Op deze manier heb ik kunnen kennismaken met
het werk in een klinisch laboratorium. Verder wil ik hem ook bedanken voor het opvolgen van
deze masterproef.
Dr. D. Borrey wil ik bedanken voor de eindeloze steun en raad bij het uitvoeren van de
proeven en het opstellen van de thesis. Ik wil haar ook graag bedanken voor de tijd die ze
besteedde aan het verbeteren van mijn masterproef.
Graag zou ik ook de laboranten bedanken die steeds klaar stonden om te helpen.
Tot slot wil ik mijn ouders, zus en vriend bedanken om te geloven in mij, en mij te steunen
wanneer het wat moeilijker ging.
Inhoudstabel
1.
INLEIDING ..................................................................................................................................... 1
1.1.
THERAPEUTISCHE DRUGMONITORING VAN BETA-LACTAM ANTIBIOTICA .................. 1
1.2.
SEPSIS EN SEPTISCHE SHOCK .............................................................................................. 2
1.2.1 Algemeen en epidemiologie .......................................................................................... 2
1.2.2 Definities ........................................................................................................................... 2
1.2.3 Pathogenese (zie figuur 1.1) .......................................................................................... 2
1.2.4 Diagnose ............................................................................................................................ 3
1.2.5 Behandeling ...................................................................................................................... 4
1.3.
ANTIBIOTICA ......................................................................................................................... 5
1.3.1 Werking ............................................................................................................................. 5
1.3.2 Resistentie ........................................................................................................................ 6
1.3.3 Bijwerkingen .................................................................................................................... 6
1.4.
Β-LACTAM ANTIBIOTICA ...................................................................................................... 7
1.4.1 Meropenem (zie figuur 1.3) ........................................................................................... 8
1.4.2 Ceftazidim en Ceftriaxon (zie figuur 1.4 en 1.5) ........................................................ 9
1.4.3 Piperacilline en flucloxacilline (zie figuur 1.6 en 1.7) ........................................... 10
1.5.
ANALYSE VAN DE BETA-LACTAM ANTIBIOTICA ............................................................. 11
1.5.1 Staalvoorbereiding ........................................................................................................ 11
1.5.2 Chromatografie .............................................................................................................. 12
1.5.3 Interne Standaard ......................................................................................................... 13
2.
OBJECTIEVEN .............................................................................................................................. 14
3.
MATERIAAL EN METHODEN .................................................................................................... 15
3.1.
TOESTELLEN (tabel 3.1) ..................................................................................................... 15
3.2.
PRODUCTEN EN REAGENTIA (tabel 3.2)........................................................................... 16
3.3.
METHODEN .......................................................................................................................... 16
3.3.1 Analyse en kwantificatie van de β-lactam antibiotica met behulp van HPLC.... 16
3.3.2 Bereiding van de stock- en werkoplossingen voor de kalibratie en de interne
standaard .................................................................................................................................... 17
3.3.3 Bereiding van de stock- en werkoplossingen voor de controle ........................... 19
3.3.4 Extractie van de standaarden en kwaliteitscontroles ............................................ 19
3.3.5 Validatie van de analyse van de β-lactam antibiotica ............................................ 19
4.
RESULTATEN .............................................................................................................................. 22
4.1.
VALIDATIE VAN DE METHODE .......................................................................................... 22
4.1.1 Herhaalbaarheid ............................................................................................................ 22
4.1.2 Reproduceerbaarheid .................................................................................................. 22
4.1.3 De juistheid ..................................................................................................................... 23
4.1.4 Lineariteit ....................................................................................................................... 24
4.1.5 LLOQ ................................................................................................................................. 25
4.1.6 De bewaarcondities van de stalen.............................................................................. 27
4.1.7 De analytische specificiteit .......................................................................................... 33
4.1.8 Besluit validatie ............................................................................................................. 35
4.2.
ANALYSE VAN PATIËNTSTAAL .......................................................................................... 35
5.
DISCUSSIE .................................................................................................................................... 40
6.
CONCLUSIE .................................................................................................................................. 42
7.
LITERATUURLIJST ..................................................................................................................... 43
Gebruikte afkortingen
C: Concentratie
CAP: Community acquired pneumonia
DAD: Diode array detector
ESI: Electrospray ionisatie
HPLC: High performance/pressure liquid chromatography
IM: Intramusculair
IV: Intraveneus
LOD: Limit of detection
LLOQ: Lower limit of quantification
MCDA: Monochoriaal Diamniotisch
MIC: Minimaal inhiberende concentratie
MS: Massaspectrometrie
MSMS: Tandem Massaspectrometrie
m/z: Massa op lading verhouding
NEC: Necrotiserende Enterocolitis
PCR: Polymerase Chain Reaction
QC: Quality Control
R2: Determinatiecoëfficiënt
Rico: Richtingscoëfficiënt
RP: Reversed Phase
Rpm: Rotaties per minuut
SD: Standaarddeviatie
S/N: Signal to noise ratio
T1/2: Halfwaardetijd
TTTS: Twin-to-Twin-Transfusion Syndroom
UV: Ultraviolet
VC: Variatiecoëfficiënt
VIS: Visible
1.
INLEIDING
1.1.
THERAPEUTISCHE DRUGMONITORING VAN BETA-LACTAM ANTIBIOTICA
Therapeutische drugmonitoring is het meten van de plasmaconcentratie van een
geneesmiddel. Hierbij wordt de totale plasmaspiegel van het geneesmiddel bepaald, dus
naast de vrije concentratie eveneens de eiwitgebonden concentratie. De meting wordt
uitgevoerd wanneer het medicijn verdeeld is over het lichaam. De concentratie in het
effectororgaan moet dus in evenwicht zijn met de plasmaconcentratie. (1, 2)
Er zijn een aantal voorwaarden verbonden aan therapeutische drugmonitoring. Zo moet
de gemeten molecule het gewenste effect teweegbrengen, de meting van de concentratie
moet nauwkeurig zijn, het farmacodynamisch effect zelf moet moeilijk te bepalen en
onmiddellijk gerelateerd zijn aan de aanwezige plasmaspiegel, het effect moet stabiel zijn, er
mag geen resistentie of tachyfylaxie optreden en als laatste mag de farmacodynamische
variabiliteit niet te groot zijn.
Therapeutische drugmonitoring wordt meestal toegepast voor medicijnen met een nauw
therapeutisch interval waarvan het effect moeilijk te meten is, of bij patiënten waarbij er
een vrijwel zekere variabiliteit van de plasmaspiegel is bij de normale therapeutische dosis.
Dit laatste is het geval bij zwaar zieke patiënten met een sepsis wanneer ze β-lactam
antibiotica toegediend krijgen. (1-4)
De dosering van de β-lactam antibiotica wordt vaak gebaseerd op farmacokinetische data,
verkregen via studies op gezonde vrijwilligers of niet-kritisch zieke patiënten. Deze dosissen
zijn natuurlijk niet automatisch therapeutisch/niet-toxisch voor mensen met een sepsis. Bij
een ernstige sepsis en septische shock is er een groter verdelingsvolume en cardiale output
van de β-lactam antibiotica. Vaak wordt ook een gestegen klaring opgemerkt, alhoewel deze
ook gedaald kan zijn wanneer er reeds orgaanschade aanwezig is. De veranderde klaring kan
tot gevolg hebben dat de plasmaconcentratie daalt. Anderzijds kan een gedaalde proteïne
binding en metabolisatie of excretie zorgen voor een hogere plasmaconcentratie. Kritisch
zieke patiënten met een sepsis worden vaak behandeld met een combinatie van een βlactam antibioticum en/of een aminoglycoside. (1, 4-7)
1
1.2.
SEPSIS EN SEPTISCHE SHOCK
1.2.1 Algemeen en epidemiologie
Ernstige sepsis en septische shock zijn even dodelijk als een hartinfarct en een ‘transient
ischemic attack’. De mortaliteit van ernstige sepsis en septische shock bedraagt ongeveer
50%. Bovendien is 2% van alle ziekenhuisopnames te wijten aan sepsis. Ongeveer 9% van de
patiënten met een sepsis ontwikkelen een ernstige sepsis en 3% van deze ontwikkelen een
septische shock. Factoren die zorgen voor een groter risico zijn kanker, immunodeficiëntie,
chronisch orgaanfalen, iatrogene factoren en ook genetische factoren. (8, 9)
1.2.2 Definities
Sepsis is een combinatie van zowel een infectie als een systemisch inflammatoir respons
syndroom. De diagnose systemisch inflammatoir respons syndroom wordt gebruikt als twee
of meer van volgende symptomen aanwezig zijn: hypothermie of hyperthermie, tachycardie,
tachypneu en een groot aantal witte bloedcellen (>12.000/mm3) of juist een zeer klein
aantal (<4.000/mm3). Het is niet noodzakelijk dat een sepsis veroorzaakt wordt door een
bacterie, dit kan namelijk ook door een virus of fungi ontstaan. Hemodynamische
instabiliteit is ook geen noodzakelijke parameter voor een sepsis. (8, 10-12)
Ernstige sepsis wordt gedefinieerd als de aanwezigheid van een sepsis en daarnaast
orgaandysfunctie. Voorbeelden van orgaandysfunctie zijn coagulopathieën, veranderde
mentale status, trombocytopenie, nier- /lever- of hartstoornissen. (8, 10-12)
Men spreekt van een septische shock bij sepsis gecombineerd met hypotensie. Vaak is het
in de kliniek moeilijk om het verschil te maken tussen ernstige sepsis en septische shock. (8,
10-12)
1.2.3 Pathogenese (zie figuur 1.1)
Verschillende pathologieën kunnen de overgang van een sepsis naar ernstige sepsis of
septische shock faciliteren. Meer dan 80% van de gevallen van sepsis worden veroorzaakt
door thoracale, abdominale, genito-urinaire en hematologische infecties. (9, 10)
2
Figuur 1.1: Pathogenese van sepsis (8)
Bij de aanwezigheid van een infectie in het menselijk lichaam worden monocyten,
macrofagen en neutrofielen geactiveerd. Deze zullen interageren met het endotheel op de
plaats van de infectie. Door de activatie van de bovengenoemde cellen en de beschadiging
van het endotheel, de cascade van het complement systeem en de beginnende coagulatie
worden cytokines aangetrokken naar de plaats van de infectie. Naast de destructie van
micro-organismen, zijn cytokines verantwoordelijk voor de inflammatiereactie. Toxines
geproduceerd door micro-organismen kunnen ook aanleiding geven tot sepsis. De
inflammatie zorgt voor verhoogde permeabiliteit van de bloedvatwand, trombose en micro
vasculaire stoornissen. De diffuse verstoring van de endotheliale integriteit geeft aanleiding
tot weefselhypoxie en orgaandysfunctie. (8, 10, 13)
In het beginstadium is er vooral een verhoging aan inflammatoire stoffen, maar na
verloop van tijd ontstaat een anti-inflammatoire immunosuppressieve status. Mensen met
een sepsis zijn dus ook gevoeliger voor nieuwe infecties. (9, 10, 14)
1.2.4 Diagnose
Het is belangrijk een sepsis zo vroeg mogelijk te diagnosticeren. Concreet betekent dit dat
de infectie die de sepsis veroorzaakt zo vlug mogelijk moet herkend worden. De infectie is in
sommige gevallen heel duidelijk, bijvoorbeeld bij cellulitis, toxisch shock syndroom,
community acquired pneumonia (CAP). Veel ziektes zoals hyperthyroïdie, arteriosclerose en
cirrose mimeren de tachycardie die ook aanwezig is bij sepsis. (9)
3
Een bloed- en urinekweek of weefselcultuur is noodzakelijk om de onderliggende oorzaak
van de mogelijke sepsis te identificeren. Op deze manier is het ook mogelijk de correcte
antibiotica toe te dienen. De klassieke bloed- of weefselculturen zullen in de toekomst
waarschijnlijk vervangen worden door screening op tien bacteriële species die vaak
voorkomen bij sepsis via polymerase chain reaction (PCR) of via de snelle detectie via een
DNA-microarray. Er is reeds onderzoek uitgevoerd voor selectieve en specifieke bio merkers,
maar tot nu toe zijn deze niet ontdekt. (9)
Tekens van hypoperfusie zijn oligurie, mentale verwardheid, vlekjes op de huid,
vertraagde capillaire refill en hyperlactatemie. Oligurie wordt meestal pas na enkele uren
opgemerkt en mentale verwardheid is moeilijk in te schatten bij een overgrote meerderheid
van patiënten. Scores voor orgaanfalen houden vaak geen rekening met reeds vooraf
bestaande orgaanschade en er bestaan ook veel verschillende definities voor. (9)
Een definitieve diagnose van septische shock kan gesteld worden wanneer een infectie
klinisch schijnbaar aanwezig is en microbiologisch bevestigd wordt zonder andere acute
ziekte. Septische shock is waarschijnlijk wanneer een infectie klinisch schijnbaar aanwezig is
zonder dat deze microbiologisch aantoonbaar is. Wanneer een andere acute ziekte mogelijks
de oorzaak is van het falen van organen en er geen microbiologisch gedocumenteerde
infectie aangetoond is, is het onwaarschijnlijk dat het om een septische shock gaat. (9)
1.2.5 Behandeling
Hoewel cytokines zoals TNF-alfa en interleukine-1 beschouwd worden als de veroorzakers
van een inflammatie hebben zij ook positieve effecten, aangezien tijdens de infectie een
inhibitie van de receptoren voor deze stoffen de genezingskans vermindert. (14)
Preventie van sepsis bestaat uit het geven van vaccins en immunoglobulines, de glycemie
spiegel tussen 4 mmol/l en 6 mmol/l in stand houden, risicopatiënten profylactisch
antibiotica geven, preventie van iatrogene infecties en selectieve decontaminering van het
spijsverteringskanaal en de orofarynx. Enterale nutritionele supplementering, vooral van Larginine, kan zorgen voor een daling van de infecties in kritisch zieke patiënten en na
electieve operaties, maar kunnen ook zorgen voor een stijging van de mortaliteit. (14, 15)
4
Patiënten die gediagnosticeerd worden met een septische shock, worden onmiddellijk
overgebracht naar de intensieve zorgen van een ziekenhuis. Verpleging, ogenblikkelijke
controle van infectie en de hemodynamische status, ondersteuning van het immuunsysteem
en de preventie van orgaanfalen is essentieel. (14-16)
Snelle verwijdering van het geïnfecteerd weefsel via chirurgie en/of toediening van
antibiotica is levensreddend. Rehydratie moet zo vroeg mogelijk opgestart worden samen
met de monitoring van de centraal veneuze zuurstofsaturatie en de klinische symptomen.
Als de hypotensie afkomstig is van een verminderde myocardiale output, kunnen eerst
inotropica gebruikt worden in plaats van vasopressors. Eventueel kan het nodig zijn om de
hemodynamische status te herstellen met behulp van bloedtransfusie, of zeldzamer
vasodilatoren. De patiënten moeten daarnaast ook behandeld worden met zuurstof. Nadat
de patiënt ontslaan is uit het ziekenhuis blijft opvolging noodzakelijk. (14, 15)
1.3.
ANTIBIOTICA
1.3.1
Werking
Antibiotica worden gebruikt bij bacteriële infecties. Antibiotica inhiberen specifieke
cruciale processen van een bacterie. De groei van de bacterie wordt dus geremd, dit kan
tijdelijk of definitief zijn. Als de groei van de bacterie definitief geïnhibeerd wordt, spreekt
men van bactericide antibiotica. In het andere geval is het een bacteriostatisch antibioticum.
Een bacteriostatisch middel is meestal evenwaardig aan een bactericide bij een volwaardig
immuunsysteem, het immuunsysteem zal bij een bacteriostatisch antibioticum de overige
bacteriën uitschakelen.
Een antibioticum is slechts werkzaam boven de minimaal inhiberende concentratie (MIC).
Er zijn concentratie-afhankelijke antibiotica en tijdsafhankelijke antibiotica.
Bij tijdsafhankelijke antibiotica hangt de werkzaamheid af van de tijd dat de
plasmaconcentratie zich boven de MIC bevindt. Het is dus beter om deze geneesmiddelen
vaker te doseren. Concentratieafhankelijke antibiotica worden gekenmerkt door een postantibiotisch effect. Naargelang de hoogte van de piekconcentratie hebben deze antibiotica
een langere werkingsduur. (17)
5
1.3.2
Resistentie
Resistentie tegen bepaalde antibiotica kan oorspronkelijk aanwezig zijn in de bacterie,
maar kan ook verworven zijn. Verworven resistentie ontstaat spontaan door een mutatie in
de bacterie of door overdracht van genetisch materiaal van een resistente bacterie naar een
niet-resistente bacterie.
Als een antibioticum toegediend wordt in een concentratie die zich maar net boven de
MIC bevindt, dan worden enkel de zeer gevoelige bacteriën gedood. Hierdoor ontstaat een
meer resistente bacteriekloon. Het is dus noodzakelijk de antibiotica in voldoende hoge
dosis te doseren. Resistentie ontstaat ook door het onzorgvuldig gebruik van antibiotica,
bijvoorbeeld onvolledig uitnemen van de medicatie. (17-19)
1.3.3
Bijwerkingen
In het menselijk lichaam bevinden zich op vele plaatsen bacteriën, bijvoorbeeld de
bacteriën in de darmen, die essentieel zijn. De antibacteriële geneesmiddelen beïnvloeden
ook deze bacteriën. Diarree, gist- en schimmelinfecties zijn dus frequente bijwerkingen van
een antibioticatherapie. (17)
6
1.4.
Β-LACTAM ANTIBIOTICA
Deze groep antibiotica wordt gekenmerkt door de aanwezigheid van een β-lactam ring. Er
bestaan verschillende subgroepen β-lactam antibiotica, de penicillines, de cefalosporines, de
carbapenems en de monobactams. Deze subgroepen verschillen in hun basisstructuur, zie
figuur 1.2. (17, 19, 20)
Penicilline
Cefalosporine
Monobactam
Carbapenem
Figuur 1.2: Structuren van de β-lactam antibiotica
(http://protein.bio.msu.ru/biokhimiya/contents/v75/full/75130303.html)
β-lactam antibiotica zijn tijdsafhankelijke antibiotica, enkel de carbapenems worden
gekenmerkt door een post-antibiotisch effect. Deze antibiotica zorgen ervoor dat de
biosynthese van het peptidoglycaan van de bacteriën geïnhibeerd wordt. Zowel
grampositieve als gramnegatieve bacteriën bevatten een laag peptidoglycanen als onderdeel
van hun celwand. Deze laag zorgt ervoor dat de bacterie zijn vorm behoudt, en zorgt
daarnaast ook voor stevigheid. Wanneer deze laag ontbreekt, zal de bacterie afsterven. (17)
Sommige bacteriën produceren β-lactamasen. β-lactamase hydrolyseert de β-lactam ring
van het antibioticum. Het antibioticum wordt dus inactief. Vaak worden deze antibiotica dus
samen gegeven met een β-lactamase inhibitor. (17)
Meropenem, ceftazidim, piperacilline, ceftriaxon en flucloxacilline worden in dit eindwerk
bestudeerd.
7
1.4.1
Meropenem (zie figuur 1.3)
1.4.1.1. Plaatsbepaling
Figuur 1.3: Structuur van meropenem (http://cenblog.org/thehaystack/2011/06/front-line-antibiotics-to-fight-e-coli/)
Meropenem behoort tot de klasse van de carbapenems. Het is een breedspectrum
antibioticum dat intraveneus (IV) wordt toegediend bij bacteriële infecties. Om resistentie te
voorkomen is het aanbevolen meropenem enkel bij ernstige infecties te gebruiken waarbij
cefalosporines of penicillines onvoldoende werkzaam zijn. Meropenem kan ook worden
gebruikt bij ernstige nierfunctiestoornissen mits dosisaanpassing. (17, 21)
1.4.1.2. Interacties en bijwerkingen
De carbapenems zorgen voor bijwerkingen ter hoogte van het centrale zenuwstelsel,
zoals convulsies, hallucinaties, myoclonieën en verwardheid. Ze zorgen ook voor een daling
van de plasmaconcentratie van het anti-epilepticum valproïnezuur en voor een verlaging van
de drempel voor convulsies.
Meropenem zelf veroorzaakt vaak trombocytopenie. (17)
1.4.1.3. Farmacokinetiek en dosering
Meropenem dringt goed door in de meeste weefsels en in lichaamsvloeistoffen. Het
geneesmiddel heeft een lage proteïne binding (2%). 70% van het geneesmiddel wordt
onveranderd geëlimineerd via de nieren. De halfwaardetijd (T1/2) bedraagt ongeveer 1 uur.
Meropenem dient IV te worden toegediend gedurende 15-30 minuten. (17, 20-22)
8
1.4.2
Ceftazidim en Ceftriaxon (zie figuur 1.4 en 1.5)
Figuur 1.4: Structuur van ceftazidim
(http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Ce
ftazidime.png)
Figuur 1.5: Structuur van ceftriaxon
(http://de.wikipedia.org/wiki/Ceftriaxon)
1.4.2.1. Plaatsbepaling
Ceftazidim en ceftriaxon zijn breedspectrum, semisynthetische antibiotica. Ze behoren tot
de derde groep cefalosporines. De cefalosporines van de derde groep mogen enkel gebruikt
worden bij de behandeling van ernstige infecties waarbij ziekenhuisopname noodzakelijk is.
(17)
1.4.2.2. Interacties en bijwerkingen
De cefalosporines kunnen mogelijks hematologische stoornissen veroorzaken, zoals
hemolytische anemie, nefrotoxiciteit en eerder zeldzaam hepatische stoornissen. Ceftazidim
kan neurotoxiciteit veroorzaken bij hoge plasmaconcentraties. Bij IV toediening ontstaat
vaak flebitis, na intramusculaire (IM) toediening pijn en lokale infectie. Een nevenwerking
van ceftriaxon is de complexvorming met calcium, ter hoogte van de galblaas, wat kan
zorgen voor galblaaskolieken. (17)
1.4.2.3. Farmacokinetiek en dosering
Ceftazidim wordt voornamelijk onveranderd geëxcreteerd via de nieren en heeft een lage
proteïnebinding (17%). Het verspreidt zich voldoende in lichaamsvochten. De T1/2 bedraagt
ongeveer 2 uur. Het kan zowel IM als IV worden toegediend. IM toediening is enkel
aangewezen wanneer IV toediening ongeschikt of niet mogelijk is. Ceftazidim dient
9
intermittent, om de acht uur, te worden toegediend. Bij ernstige infecties is het mogelijk de
dosis of de doseerfrequentie te verhogen. (17, 20, 23)
Ceftriaxon verspreidt zich snel in het weefselvocht en heeft een lange halfwaardetijd (8
uur). De halfwaardetijd is verlengd bij patiënten met een gecombineerde lever- en
nierfunctiestoornis. Het heeft een hoge proteïnebinding, die afhankelijk is van de
concentratie, voor concentraties lager dan 100 µg/ml heeft ceftriaxon een proteïne binding
van ongeveer 95%, voor hogere concentraties ligt de proteïnebinding merkelijk lager. Het
geneesmiddel wordt gedeeltelijk onveranderd geëxcreteerd via de urine en gedeeltelijk via
de feces. Ceftriaxon kan IV of IM over 30 minuten of langer worden toegediend. De dosering
moet aangepast worden indien er een nierfunctiestoornis of leverfunctiestoornis aanwezig is.
(17, 20)
1.4.3
Piperacilline en flucloxacilline (zie figuur 1.6 en 1.7)
Figuur 1.6: Structuur van piperacilline
(http://www.pharmawiki.ch/wiki/index.php
?wiki=Piperacillin&Spez=True)
Figuur 1.7: Structuur van flucloxacilline
(http://rissubscontchel.nazuka.net/q.php?n=
699-amoxicillin-vor-dem-essen)
1.4.3.1. Plaatsbepaling
Piperacilline is een breedspectrum penicilline. Het wordt aanbevolen piperacilline enkel
te gebruiken in hospitaalmilieu. Flucloxacilline is een penicillinase resistent smallspectrumpenicilline en wordt voornamelijk gebruikt voor de behandeling van huidinfecties
zoals cellulitis wanneer een antibioticakuur noodzakelijk is. (17)
10
1.4.3.2. Interacties en bijwerkingen
Penicillines kunnen aanleiding geven tot allergische reacties, eventueel zelfs tot een
anafylactische shock. Flucloxacilline kan zorgen voor cholestatische hepatitis. (17)
1.4.3.3. Farmacokinetiek en dosering
Piperacilline wordt voornamelijk onveranderd geëxcreteerd via de nieren. Het wordt
samen toegediend met tazobactam, dit zorgt ervoor dat het antibioticum niet wordt
afgebroken door β-lactamase. Piperacilline heeft een T1/2 van ongeveer 1 uur en een
proteïnebinding van 30%. Het geneesmiddel verspreidt zich goed naar andere weefsels.
Piperacilline wordt best via een langzame IV injectie (3-5 min) of via een IV infuus met een
inlooptijd van 30 min toegediend. (17, 20, 24)
Flucloxacilline kan oraal, parenteraal, intra-pleuraal, of intra-articulair worden toegediend.
Oraal moet het geneesmiddel op een lege maag worden ingenomen. Het heeft een zeer
hoge plasma-eiwitbinding (95%). Ondanks de hoge proteïnebinding verspreidt flucloxacilline
zich wel goed naar andere weefsels. Ongeveer de helft wordt onveranderd geëlimineerd via
de urine. Bij ernstige nierfunctiestoornissen is een dosisverlaging of een verhoging van het
doseerinterval aangewezen. Flucloxacilline heeft een T1/2 van ongeveer 1 uur. (17, 20, 25)
1.5.
ANALYSE VAN DE BETA-LACTAM ANTIBIOTICA
1.5.1
Staalvoorbereiding
1.5.1.1. Vaste fase extractie
Vaste fase extractie geeft redelijk goede terugvindbaarheden (‘recoveries’), voor deze
methode zijn echter grote plasmavolumes noodzakelijk. Deze methode is ook duur. Twee
extractiekolommen worden vaak beschreven in de literatuur, C-18 kolommen en Oasis® HLB
kolommen. Van der Waalskrachten weerhouden het analyt bij de C-18 kolommen, terwijl
verschillende polaire en apolaire interacties zorgen voor de weerhouding bij de Oasis® HLB
kolommen. (26-30)
11
1.5.1.2. Ultrafiltratie
Ultrafiltratie is een goede extractiemethode met goede ‘recoveries’. Nadeel van deze
methode is dat deze zeer duur is. Ultrafiltratie vereist materialen die niet standaard in elk
laboratorium aanwezig zijn. (26, 31-33)
1.5.1.3. Methanol/Acetonitrile precipitatie
Deze methode wordt vaak toegepast voor de staalvoorbereiding van β-lactam antibiotica.
Deze methode is geschikt voor alle β-lactam antibiotica die onderzocht worden in dit
eindwerk. Methanol/acetonitrile precipitatie is de meest reproduceerbare methode en geeft
ook de beste recovery. Daarnaast is deze ook een stuk goedkoper dan ultrafiltratie en vaste
fase extractie. (26, 34-38)
1.5.2
Chromatografie
High performance/pressure liquid chromatography (HPLC) in combinatie met een diode
array detector (DAD) wordt in de farmaceutische industrie zeer vaak gebruikt voor de
scheiding,
identificatie
en
gehaltebepaling
van
componenten.
Stoffen
kunnen
geïdentificeerd worden door de retentietijd te vergelijken met de retentietijd van
referentiestoffen en aan de hand van spectra. Voor analyse van de β-lactam antibiotica
wordt normaal gebruik gemaakt van reversed-phase C18P-kolommen. Deze hebben licht
polaire eigenschappen. Een normale C18-kolom wordt gefabriceerd door de silica van een
kolom te derivatiseren met C18-ketens, de resterende vrije silanol-groepen ondergaan
vervolgens een end-capping met methyl ketens. Op deze manier zijn alle silanol-groepen
afgeschermd en worden polaire interacties tussen de stationaire fase en de te analyseren
componenten vermeden. Bij een C18P-kolom wordt de silica gecontroleerd gederivatiseerd,
zodat een vast percentage vrije silanol-groepen overblijft. De niet gederivatiseerde silanolgroepen kunnen polaire interacties ondergaan met de te analyseren componenten. Door
deze wijziging wordt de elutietijd voor polaire componenten verlengd en voor apolaire
verkort. (34, 37, 39)
12
De mobiele fase bestaat meestal uit fosfaatbuffer en acetonitrile. Het gebruik van een
zure pH zorgt voor de beste scheiding. De gradiëntelutie met acetonitrile zorgt voor een
kortere elutietijd van de meest apolaire β-lactam antibiotica. (34, 39)
Als detector wordt een DAD zeer veel gebruikt; afhankelijk van het absorptiemaximum
van het specifieke β-lactam antibioticum wordt een bepaalde golflengte geselecteerd voor
weergave van het chromatogram. Soms wordt massaspectrometrie of tandem
massaspectrometrie (MS of MSMS) gebruikt als detector. De ionen worden gevormd via
electrospray ionisatie (ESI) en de scheiding volgens de m/z waarde gebeurt via MS of MSMS.
(29, 34, 36, 38, 40)
1.5.3
Interne Standaard
Aangezien de β-lactam antibiotica een extractie ondergaan voordat ze geïnjecteerd worden
op de HPLC is het nauwkeuriger een inwendige standaard te gebruiken. Deze inwendige
standaard wordt toegevoegd voor de extractie, zo wordt gecorrigeerd voor eventuele
verliezen.
Figuur 1.8: Structuur van cefoperzone
(http://www.chemicalbook.com/ChemicalPr
oductProperty_EN_CB4752040.htm)
Cefoperazone is een β-lactam antibioticum, dat behoort tot de derde groep cefalosporines
(zie figuur 1.8). Dit geneesmiddel is niet beschikbaar in België. (17)
Het antibioticum heeft een retentietijd gelijkaardig aan de onderzochte β-lactam antibiotica.
Deze stof wordt bovendien reeds gebruikt als interne standaard in andere analyses in het
laboratorium.
13
2.
OBJECTIEVEN
β-lactam antibiotica worden vaak gebruikt bij sepsis. Er bestaat veel onenigheid over de
concentraties waarbij de β-lactam antibiotica werkzaam zouden zijn. Vaak is het voor de
dokters niet duidelijk welke dosis zij moeten toedienen aan patiënten met sepsis, aangezien
deze patiënten ernstig ziek zijn en de plasmaconcentraties bij toediening van standaard
dosissen anders kunnen liggen dan bij gezonde mensen.
Er is dus de noodzaak een methode te ontwikkelen die voldoende specifiek en selectief
meropenem, piperacilline, flucloxacilline, ceftriaxon en ceftazidim kan kwantificeren. Deze βlactam antibiotica worden namelijk vaak gebruikt in het ziekenhuis. De methode moet een
eenvoudige staalvoorbereiding hebben en de analysetijd moet zo beperkt mogelijk zijn,
opdat de dosis voor elke patiënt snel geoptimaliseerd kan worden. In de literatuur worden al
vele methoden beschreven hoe zulke analyses uitgevoerd kunnen worden. Toch is dit
onderzoek zeker nuttig aangezien de analyse goed moet aansluiten bij de routinemethodes
die reeds uitgevoerd worden. Op deze manier is het mogelijk tussen de andere routinetesten
een staal te analyseren.
In deze thesis worden ook de bewaarcondities van de onderzochte β-lactam antibiotica
getest bij verschillende omstandigheden -kamertemperatuur, koelkast, diepvries-, zodat de
te volgen procedure voor de preanalytische fase kan uitgewerkt worden met duidelijke
richtlijnen betreffende de staalname, de temperatuur bij transport en de bewaarcondities
tot analyse. Dit laatste is belangrijk aangezien er vaak een tijdspanne is tussen de
staalafname en de analyse.
Ten slotte worden enkele farmacokinetische parameters van meropenem bij een
premature neonaat bepaald aan de hand van een patiëntmodel.
14
3.
MATERIAAL EN METHODEN
3.1.
TOESTELLEN (tabel 3.1)
Tabel 3.1: gebruikte toestellen
Soort toestel
Toestel
Labonummer
Leverancier
Mettler Toledo
Weegschaal
Mettler Toledo AT261 Balans
LOPCTBA00001 (Zaventem,
België)
Thermo Fisher
Droogdamper
VLM EC2
CSCHTVE00004
Scientific
(Erembodegem,
België)
Centrifuge
Eppendorf Centrifuge 5417C
CSCHTCE00002
VWR
(Leuven,
België)
L-2455U Fotodiode
HITACHI
HPLC
LaChrom
ULTRA
array detector
L-2300 Kolomoven
L-2200U
autosampler
CSCHTAP00021
VWR
(Leuven,
België)
L-2160U Pomp
Data
acquisitie
HPLC
EZChrom Elite
Nucleodur®
RP
C18
Pyramid
column
Kolom HPLC
Lengte: 150 mm
Interne diameter: 4,6 mm
CSR00215
Filter
Service
(Eupen, België)
Partikelgrootte: 5 µm
15
3.2.
PRODUCTEN EN REAGENTIA (tabel 3.2)
Tabel 3.2: Gebruikte producten en reagentia
Fysiologische oplossing
Huisbereiding: CSCHRIB00113
Fosfaatbuffer pH 3
Huisbereiding: CSCHRIB00049
Methanol
HPLC grade Panreac (Barcelona, Spain)
Acetonitrile
HPLC grade (Scharlau, TMC, België)
Meropenem
Meropenem® 500 mg
Ceftriaxon
Ceftriaxone Sandoz® 1 g
Ceftazidim
Glazidim® 1 g
Flucloxacilline
Floxapen® 1 g
Piperacilline
Tazocin® 2 g
Cefoperazone
CSR00195-Sigma Aldrich BVBA
3.3.
METHODEN
3.3.1
Analyse en kwantificatie van de β-lactam antibiotica met behulp van HPLC
In deze methode wordt gebruik gemaakt van een NUCLEODUR® RP C18 Pyramid-kolom.
Dit is ‘reversed phase’ chromatografie, waarbij de stationaire fase apolair, en de mobiele
fase polair is. Toch heeft de kolom ook licht polaire eigenschappen, waardoor de elutietijd
van de meest polaire β-lactam antibiotica langer is en er minder piekverbreding optreedt
voor de apolaire β-lactam antibiotica. De detector is hier een fotodiode array detector (DAD),
deze meet de absorptie in functie van de tijd over het gehele UV/VIS spectrum, maar geeft
een chromatogram weer bij een bepaalde golflengte. De golflengte die weergegeven wordt
kan zelf gekozen worden, meestal wordt gekozen voor de maximale absorptiegolflengte. De
absorptie van meropenem wordt bepaald bij 300 nm, van cefoperazone, piperacilline en
flucloxacilline bij 240 nm en van ceftazidim en ceftriaxon bij 290 nm. De mobiele fase bestaat
uit twee oplossingen, fosfaatbuffer pH 3 en acetonitrile. Er wordt een lineaire gradiënt
gebruikt, weergegeven in tabel 3.3.
16
Tabel 3.3: samenstelling mobiele fase
Tijd (min)
% solvent A (fosfaatbuffer pH 3)
% solvent B (acetonitrile)
0
95
5
20
50
50
20,2
95
5
30
95
5
De totale looptijd van elk staal is 30 minuten bij een flow van 1 ml/min. De temperatuur
van de oven bedraagt 35°C. Het injectievolume is 20 µl per staal.
Het gehalte van de stoffen wordt in deze proef bepaald via interne standaardisatie, zoals
beschreven onder 1.5.3.
3.3.2
Bereiding van de stock- en werkoplossingen voor de kalibratie en de
interne standaard
3.3.2.1. Aanmaken van de stockoplossingen (50mg/ml) van de β-lactam antibiotica
500 mg meropenem (Meropenem® 500 mg) wordt opgelost in gedestilleerd water en
aangelengd tot 10,00 ml.
1 g ceftazidim (Glazidim® 1 g), ceftriaxon (Ceftriaxone Sandoz® 1 g) en flucloxacilline
(Floxapen® 1 g) worden elk apart opgelost in gedestilleerd water en aangelengd tot 20,00 ml.
2 g piperacilline (Tazocin® 2 g) wordt opgelost in gedestilleerd water en aangelengd tot
40,00 ml.
Deze stockoplossingen hebben dus een concentratie van 50 mg/ml.
3.3.2.2. Aanmaken van de werkoplossingen en standaarden van de β-lactam antibiotica
Werkoplossing 10 mg/ml
Van elke stockoplossing wordt 200 µl genomen en gemengd.
Werkoplossing 2 mg/ml
200 µl van de werkoplossing van 10 mg/ml wordt toegevoegd aan 800 µl fysiologische
oplossing.
Werkoplossing 200 µg/ml
100 µl van de werkoplossing van 2 mg/ml wordt samengevoegd met 900 µl fysiologische
oplossing.
17
Werkoplossing 20 µg/ml
100 µl van de werkoplossing van 200 µg/ml wordt gemengd met 900 µl fysiologische
oplossing.
Deze werkoplossingen worden gebruikt voor het aanmaken van de kalibratoren zoals
weergegeven in tabel 3.4. Het werkgebied wordt gekozen in functie van gegevens uit de
literatuur. (26, 39)
Tabel 3.4: aanmaak standaardoplossingen
Werkoplossing Werkoplossing Werkoplossing Serum Concentratie
20 µg/ml (µl)
200 µg/ml (µl)
2 mg/ml (µl)
(µl)
(µg/ml)
/
/
/
1000
0
100
/
/
900
2
/
25
/
975
5
/
50
/
950
10
/
125
/
875
25
/
/
25
975
50
/
/
50
950
100
/
/
75
925
150
/
/
100
900
200
De kalibratoren worden verdeeld in volumes van 200 µl en in de diepvries geplaatst bij
-80°C.
3.3.2.3. Aanmaken van de methanol + cefoperazone (25 µg/ml) oplossing
2,5 mg cefoperazone wordt opgelost in methanol en aangelengd tot 100 ml met
methanol.
18
3.3.3
Bereiding van de stock- en werkoplossingen voor de controle
Net zoals in 3.3.2.2. worden werkoplossingen aangemaakt van 10 mg/ml, 2 mg/ml en 200
µg/ml. De kwaliteitscontroles worden aangemaakt zoals in tabel 3.5. Wanneer de HPLC alle
standaarden en kwaliteitscontroles heeft geanalyseerd, kunnen de concentraties van de
kwaliteitscontroles berekend worden via de ijklijn.
Tabel 3.5: aanmaak kwaliteitscontroles
Werkoplossing
Werkoplossing
Werkoplossing Serum (µl)
Concentratie
20 µg/ml (µl)
200 µg/ml (µl)
2 mg/ml (µl)
(µg/ml)
/
20
/
980
4
/
100
/
900
20
/
/
40
960
80
/
/
80
920
160
Zoals de standaarden, worden de kwaliteitscontroles na aanmaak ook verdeeld in
volumes van 200 µl en in de diepvries bij -80°C geplaatst.
3.3.4
Extractie van de standaarden en kwaliteitscontroles
Van elke standaard en kwaliteitscontrole wordt een hoeveelheid van 200 µl uit de
diepvries gehaald. Aan elk van deze stalen wordt 400 µl methanol + cefoperazone
toegevoegd. Na kort mengen worden de stalen onmiddellijk gecentrifugeerd voor 5 minuten
aan 14000 rotaties per minuut (rpm). De bovenstaande vloeistof wordt overgebracht in een
proefbuis en ingedampt onder N2. Nadien wordt het residu heropgelost in 100 µl
fosfaatbuffer pH 3. Deze oplossing wordt overgebracht in een vial met insert, en 20 µl wordt
geïnjecteerd op de HPLC-DAD.
3.3.5
Validatie van de analyse van de β-lactam antibiotica
De methodevalidatie wordt uitgevoerd volgens de standaard richtlijnen voor
methodevalidatie van chromatografische analysemethoden zoals beschreven door F. Peters
(For. Sci. Int. 165 (2007) 216-224; Validation of new methods). De parameters die bepaald
worden zijn de herhaalbaarheid, de reproduceerbaarheid, de juistheid, de lineariteit, de
detectielimiet en de kwantificatielimiet, de bewaarcondities van de stalen en de analytische
specificiteit.
19
3.3.5.1. De herhaalbaarheid
De herhaalbaarheid of de intra-assay precisie wordt gedefinieerd als de nauwkeurigheid
wanneer dezelfde parameters, solventen, reagentia en materialen worden gebruikt. Er
worden zes verschillende stalen voor kwaliteitscontroles aangemaakt en geanalyseerd. Voor
elk concentratieniveau wordt vervolgens het gemiddelde, de standaarddeviatie (SD) en de
variatiecoëfficiënt (VC) berekend. De variatiecoëfficiënt mag maximaal 10% zijn,
uitgezonderd voor de LLOQ, hierbij mag de VC 15% zijn.
3.3.5.2. De reproduceerbaarheid
De reproduceerbaarheid of de inter-assay precisie wordt gedefinieerd als de
nauwkeurigheid onder verschillende omstandigheden. Hiervoor worden 6 verschillende
stalen voor kwaliteitscontroles aangemaakt op verschillende dagen en geanalyseerd. Voor
elk concentratieniveau wordt vervolgens het gemiddelde, de SD en de VC bepaald. De
variatiecoëfficiënt mag maximaal 15 % zijn, met uitzondering van de LLOQ, hierbij mag de VC
20% zijn.
3.3.5.3. De lineariteit
De ijklijn wordt met behulp van de standaardreeks, zoals beschreven in 3.3.2. opgesteld.
De concentraties zijn verdeeld over het gehele werkgebied en de kalibratoren worden
opgemaakt in de blanco matrix die geschikt bevonden werd op basis van preliminaire
experimenten. Er wordt ook een nulstandaard met interne standaard geanalyseerd ter
controle.
3.3.5.4. LOD en LLOQ
De ‘limit of detection’ of LOD is de concentratie van een component die net nog met
genoeg zekerheid kan geïdentificeerd worden in een plasmastaal. De signaal tot
ruisverhouding (S/N) van de LOD is minimaal gelijk aan drie. De ‘lower limit of quantification’
of LLOQ is de laagste concentratie van een component die gekwantificeerd kan worden in
een plasmastaal. De S/N waarde van de LLOQ is minimaal gelijk aan 10. De LLOQ wordt
geanalyseerd op twee verschillende dagen in drievoud.
3.3.5.5. De bewaarcondities van de stalen
De chemische stabiliteit van de stalen wordt gedefinieerd in een bepaalde matrix, onder
specifieke condities en voor een gegeven tijdsinterval. De stabiliteit van de geanalyseerde
component in een bepaalde matrix moet verzekerd zijn tijdens de pre-analytische fase en
20
tijdens de analytische procedure, opdat het resultaat betrouwbaar zou zijn. Voor deze test
worden de kwaliteitscontroles geanalyseerd nadat ze drie vries-dooi cycli hebben ondergaan,
of nadat ze 5 uur en 24 uur bij kamertemperatuur in het donker en in het licht geplaatst zijn.
Daarnaast wordt nagegaan of de stalen gedurende een dag stabiel zijn in de koelkast of
diepvries. Ten slotte wordt getest of de extracten in de lader stabiel blijven. Er wordt
gesproken van significante afbraak wanneer de bias van de stalen groter is dan 10% voor een
bepaalde component.
3.3.5.6. De analytische specificiteit
10 plasmastalen van verschillende patiënten worden geprecipiteerd zonder toevoeging
van een interne standaard. Hierna worden ze geïnjecteerd en geanalyseerd. De bedoeling
van de test is om interferenties op de retentietijd van de onderzochte β-lactam antibiotica
en de interne standaard op te sporen.
3.3.5.7. De juistheid
Op basis van de 6 waarden verkregen bij het testen van de reproduceerbaarheid wordt
voor elk concentratieniveau de fout van de gemiddelde waarde ten opzichte van de
werkelijke waarde berekend. De bias mag maximaal 10 procent zijn met uitzondering van de
LLOQ, waar een bias van 15% toegestaan wordt.
21
4.
RESULTATEN
4.1.
VALIDATIE VAN DE METHODE
4.1.1 Herhaalbaarheid
In tabel 4.1. worden de resultaten weergegeven voor de herhaalbaarheid. Hieruit kan
besloten worden dat de methode voldoet aan de voorwaarden voor de herhaalbaarheid.
Tabel 4.1: Resultaten herhaalbaarheid
Target 4 µg/ml
VC QC1 (%)
20 µg/ml
80 µg/ml
160 µg/ml
VC QC2(%)
VC QC3 (%)
VC QC4 (%)
Meropenem
5,41
6,81
4,91
3,23
Piperacilline
3,67
3,33
6,33
3,83
Flucloxacilline
8,91
2,89
5,94
2,82
Ceftazidim
6,57
6,39
6,46
3,26
Ceftriaxon
5,71
1,78
9,13
2,81
4.1.2 Reproduceerbaarheid
De resultaten voor de reproduceerbaarheid worden weergegeven in tabel 4.2, 4.3, 4.4 en
4.5. De variatiecoëfficiënt van elke component voor elke kwaliteitscontrole ligt lager dan
15%. Deze methode is dus conform met de reproduceerbaarheid.
Tabel 4.2: Resultaten reproduceerbaarheid QC1 (4 µg/ml)
Gemiddelde (µg/ml)
Standaarddeviatie
VC (%)
Bias (%)
Meropenem
3,90
0,24
6,05
-2,51
Piperacilline
4,24
0,25
5,94
6,09
Flucloxacilline
3,73
0,41
11,08
-6,86
Ceftazidim
3,94
0,44
11,18
-1,60
Ceftriaxon
3,83
0,52
13,58
-4,22
22
Tabel 4.3: Resultaten reproduceerbaarheid QC2 (20 µg/ml)
Gemiddelde (µg/ml)
Standaarddeviatie
VC (%)
Bias (%)
Meropenem
19,52
1,16
5,94
-2,42
Piperacilline
21,85
0,76
3,49
9,24
Flucloxacilline
20,91
1,63
7,81
4,55
Ceftazidim
21,71
1,57
7,25
8,53
Ceftriaxon
20,74
0,91
4,37
3,72
VC (%)
Bias (%)
Tabel 4.4: Resultaten reproduceerbaarheid QC3 (80 µg/ml)
Gemiddelde (µg/ml)
Standaarddeviatie
Meropenem
83,16
12,36
14,87
3,95
Piperacilline
84,17
5,29
6,29
5,21
Flucloxacilline
79,00
6,22
7,87
-1,25
Ceftazidim
78,77
4,22
5,36
-1,54
Ceftriaxon
78,54
7,44
9,48
-1,83
VC (%)
Bias (%)
Tabel 4.5: Resultaten reproduceerbaarheid QC4 (160 µg/ml)
Gemiddelde (µg/ml)
Standaarddeviatie
Meropenem
151,94
7,70
5,07
-5,03
Piperacilline
174,70
1,88
1,08
9,19
Flucloxacilline
156,50
6,50
4,16
-2,19
Ceftazidim
174,63
8,43
4,83
9,14
Ceftriaxon
162,96
12,95
7,94
1,85
4.1.3 De juistheid
In tabel 4.2, 4.3, 4.4 en 4.5 wordt de bias weergegeven van de kwaliteitscontroles die
geanalyseerd worden bij de inter-assay precisie. De bias ligt lager dan 10% voor elke
component op elk concentratieniveau. De methode voldoet aan dit criterium.
23
4.1.4 Lineariteit
Elke dag werd een ijklijn opgesteld voor meropenem, ceftazidim, piperacilline, ceftriaxon
en flucloxacilline, deze worden weergegeven in figuur 4.1-4.5. In tabel 4.6 worden de
richtingscoëfficiënten (rico) en de determinatiecoëfficiënten (R2) weergegeven voor elke
ijklijn.
8
Ijklijn ceftazidim
Relatieve piekhoogte
ceftazidim
Relatieve piekhoogte
meropenem
Ijklijn meropenem
y = 0,0325x + 0,0566
R² = 0,9985
6
4
2
0
0
50
100
150
5
4
3
2
1
0
200
y = 0,0233x + 0,0172
R² = 0,9984
0
50
100
150
Concentratie meropenem
Figuur 4.1: Kalibratielijn Meropenem
Ijklijn ceftriaxon
Figuur 4.2: Kalibratielijn Ceftazidim
Ijklijn flucloxacilline
Relatieve piekhoogte
flucloxacilline
Figuur 4.2: Ijklijn Ceftazidim
Relatieve piekhoogte
ceftriaxon
Figuur 4.1: Ijklijn Meropenem
4
y = 0,0177x - 0,005
R² = 0,9987
3
200
Concentratie ceftazidim
2
1
0
3
y = 0,0127x + 0,0205
R² = 0,9996
2
1
0
0
50
100
150
200
0
Concentratie ceftriaxon
50
100
150
200
Concentratie flucloxacilline
Figuur 4.4: Ijklijn Flucloxacilline
Figuur 4.3: Kalibratielijn Ceftriaxon
Ijklijn piperacilline
Figuur 4.4: Kalibratielijn Flucloxacilline
relatieve piekhoogte
piperacilline
Figuur 4.3: Ijklijn Ceftriaxon
3
y = 0,0141x - 0,0033
R² = 0,9998
2
1
0
0
50
100
150
200
Concentratie piperacilline
Figuur 4.5: Ijklijn Piperacilline
24
Figuur 4.5: Kalibratielijn Piperacilline
Tabel 4.6: Resultaten kalibratie
Meropenem
Ceftazidim
Ceftriaxon
Piperacilline
Flucloxacilline
rico
R²
rico
R²
rico
R²
rico
R²
rico
R²
Dag 1
0,0325
0,9985
0,0234
0,9983
0,0176
0,9987
0,0141
0,9999
0,0127
0,9996
Dag 2
0,0333
0,9998
0,0251
0,9986
0,0185
0,9994
0,0140
0,9984
0,0130
0,9984
Dag 3
0,0320
0,9997
0,0259
0,9997
0,0182
0,9984
0,0139
0,9991
0,0130
0,9992
Dag 4
0,0398
0,9998
0,0281
0,9999
0,0217
0,9998
0,0138
0,9997
0,0112
0,9993
Dag 5
0,0376
0,9997
0,0273
0,9997
0,0184
0,9984
0,0143
0,9992
0,0131
0,9992
Dag 6
0,0348
0,9993
0,0257
0,9995
0,0180
0,9992
0,0148
0,9989
0,0137
0,9991
VC
8,8437
0,0499
6,3559
0,0640
7,9165
0,0586
2,5418
0,0531
6,7183
0,0403
(%)
De determinatiecoëfficiënt is voor elke component minimaal 0,9983. De standaarddeviatie
op de helling is maximaal 8,8437%.
Voor meer dan 75% van de kalibratoren is de bias van de teruggerekende concentratie
kleiner dan 20%. Volgens het European Medicines Agency mag het lineair model aanvaard
worden wanneer hieraan voldaan wordt. Het lineair model wordt dus aanvaard.
(http://www.ema.europa.eu/ema/)
4.1.5 LLOQ
In tabel 4.7 worden de resultaten voor de LLOQ’s weergegeven, bekomen bij de analyses
op de eerste dag. In tabel 4.8 worden de resultaten voor de tweede analyse van de LLOQ’s
getoond. De VC is steeds kleiner dan 15%. In tabel 4.9 worden de zes resultaten
samengevoegd, de bias van de LLOQ’s ligt lager dan 15% en de VC lager dan 20%. De LLOQ
mag dus vastgelegd worden op 2 µg/ml.
25
Tabel 4.7: Resultaten LLOQ’s dag 1 (2 µg/ml)
LLOQ
LLOQ
LLOQ
Gemiddelde
SD
VC
(µg/ml)
(µg/ml)
(µg/ml)
(µg/ml)
Meropenem
1,95
2,18
2,34
2,16
0,20
9,15
Piperacilline
1,82
1,93
1,85
1,87
0,06
3,21
Flucloxacilline
1,59
1,52
1,67
1,59
0,07
4,55
Ceftazidim
1,80
1,87
1,78
1,81
0,05
2,59
Ceftriaxon
1,79
1,94
2,05
1,93
0,13
6,79
SD
VC (%)
(%)
Tabel 4.8: Resultaten LLOQ’s dag 2 (2 µg/ml)
LLOQ
LLOQ
LLOQ
Gemiddelde
(µg/ml)
(µg/ml)
(µg/ml)
(µg/ml)
Meropenem
1,92
2,38
2,33
2,21
0,25
11,31
Piperacilline
2,40
2,16
2,15
2,24
0,14
6,33
Flucloxacilline
2,36
1,94
2,19
2,16
0,21
9,91
Ceftazidim
1,61
1,76
1,80
1,72
0,10
6,02
Ceftriaxon
1,86
1,88
1,86
1,87
0,01
0,47
Tabel 4.9: Resultaten LLOQ’s (2 µg/ml)
Gemiddelde
SD
VC (%)
Bias (%)
(µg/ml)
Meropenem
2,18
0,20
9,33
9,22
Piperacilline
2,05
0,23
11,00
2,62
Flucloxacilline
1,88
0,34
18,23
-6,08
Ceftazidim
1,77
0,09
4,95
-11,59
Ceftriaxon
1,90
0,09
4,70
-5,15
26
4.1.6 De bewaarcondities van de stalen
Uit de analyse van de kwaliteitscontroles blijkt dat de stalen niet significant afbreken door
een vries-dooi cyclus. Na drie cycli liggen de concentraties van de antibiotica nog steeds
binnen de grenzen van de doelconcentratie, zie tabel 4.10.
Tabel 4.10: resultaten na 3 vries-dooi cycli
Target 4
20
80
160
µg/ml
µg/ml
µg/ml
µg/ml
Bias
Bias
Bias
Bias
QC1
QC2
QC3
QC4
(%)
(%)
(%)
(%)
Meropenem
-7,53
-7,06
-2,63
-3,58
Piperacilline
2,95
9,36
-2,90
3,83
Flucloxacilline
-3,68
-9,38
-6,49
-9,41
Ceftazidim
7,83
4,54
-5,28
8,73
Ceftriaxon
7,61
8,53
-5,03
-3,74
In tabel 4.11 worden de resultaten getoond wanneer de stalen 5 uur bij
kamertemperatuur bewaard worden. Meropenem blijkt voor drie van de vier
kwaliteitscontroles significant afgebroken te zijn in het donker, en voor twee in het licht.
Flucloxacilline is significant afgebroken voor twee kwaliteitscontroles in het donker, en voor
drie onder invloed van licht. Er kan besloten worden dat meropenem en flucloxacilline
afbraak vertonen wanneer ze 5 uur bij kamertemperatuur bewaard worden. De stalen zijn
niet lichtgevoelig.
27
Tabel 4.11: Resultaten na 5u bij kamertemperatuur
Target 4
20
80
160
µg/ml
µg/ml
µg/ml
µg/ml
Bias
Bias
Bias
Bias
(%)
(%)
(%)
(%)
Meropenem
-46,55
-16,60
-1,90
-13,36
Piperacilline
6,08
8,97
-3,44
1,84
Flucloxacilline
-19,73
-7,90
-5,42
-18,24
Ceftazidim
-2,65
0,04
6,07
-2,10
Ceftriaxon
4,48
9,25
3,88
-3,11
Meropenem
-33,58
-23,27
2,75
-9,95
Piperacilline
-2,08
7,75
-2,43
-9,33
Flucloxacilline
-6,15
-10,64
-10,60
-12,38
Ceftazidim
6,60
-2,26
6,79
-0,87
Ceftriaxon
7,93
6,08
4,92
-0,40
Donker
Licht
Aangezien er bij de stabiliteitsstudie duidelijk afbraak te zien is bij meropenem en
flucloxacilline na 5 uur, werd ook de stabiliteit getest van de β-lactam antibiotica wanneer
deze 2,5 uur bewaard worden bij kamertemperatuur. Deze testen werden meermaals
uitgevoerd. Enkele kwaliteitscontroles vertoonden significante afbraak voor meropenem en
flucloxacilline, terwijl andere kwaliteitscontroles stabiel bleken voor deze componenten. Op
basis van deze resultaten was het dus moeilijk een correct besluit te vormen. Omdat de
resultaten niet reproduceerbaar waren, werd nagegaan wat de stabiliteit voor deze
antibiotica in de literatuur was. In de literatuur zijn er ook veel tegenstrijdige resultaten. (28,
32, 35, 39)
Wanneer de stalen 24 uur bij kamertemperatuur bewaard worden (tabel 4.12) breken alle
antibiotica behalve ceftriaxon significant af. Het wordt opnieuw duidelijk dat licht geen
invloed heeft op de stabiliteit van de onderzochte antibiotica in de stalen.
28
Uit tabel 4.13 en 4.14 blijkt dat de onderzochte antibiotica in de stalen stabiel zijn
wanneer ze een dag in de koelkast (6°C) of diepvries (-20°C) geplaatst worden. De extracten
van de kalibratoren kunnen 24 uur in de staallader geplaatst worden (zie figuur 4.6-4.8),
uitgezonderd voor meropenem, voor deze component treedt lichte afbraak op.
Tabel 4.12: Resultaten na 24u bij kamertemperatuur
Target 4
20
80
160
µg/ml
µg/ml
µg/ml
µg/ml
Bias
Bias
Bias
Bias
(%)
(%)
(%)
(%)
Meropenem
-18,78
-23,41
-22,36
-18,38
Piperacilline
-17,80
-3,22
-31,63
-24,03
Flucloxacilline
-58,13
-27,87
-28,63
-24,92
Ceftazidim
-17,08
-10,01
-12,84
-5,25
Ceftriaxon
-4,60
0,62
-6,98
-5,40
Meropenem
-11,68
-28,51
-25,74
-24,46
Piperacilline
-32,73
-6,52
-28,84
-27,69
Flucloxacilline
-52,60
-27,79
-23,13
-25,91
Ceftazidim
-18,88
-15,36
-14,94
-7,05
Ceftriaxon
-7,00
1,09
-0,60
-5,14
Donker
Licht
29
Tabel 4.13: Resultaten na 24u bij 6°C
Target 4
20
80
160
µg/ml
µg/ml
µg/ml
µg/ml
Bias
Bias
Bias
Bias
(%)
(%)
(%)
(%)
Meropenem
-8,75
2,53
-6,22
-4,10
Piperacilline
-1,30
-1,05
1,73
-0,97
Flucloxacilline
-0,08
6,72
-9,07
9,21
Ceftazidim
10,48
8,14
9,90
-8,78
Ceftriaxon
0,80
2,72
1,27
11,12
Tabel 4.14: Resultaten na 24u bij -20°C
Target 4
20
80
160
µg/ml
µg/ml
µg/ml
µg/ml
Bias
Bias
Bias
Bias
(%)
(%)
(%)
(%)
Meropenem
-6,50
9,58
-4,86
-8,89
Piperacilline
0,68
-4,29
7,03
4,83
Flucloxacilline
7,50
3,36
-3,25
-10,31
Ceftazidim
-2,50
8,36
5,14
10,88
Ceftriaxon
-5,18
-4,00
1,50
-3,32
30
Meropenem
Piek extract van kalibrator 7
Piek extract van kalibrator 7 na 24
uur in staallader
Figuur 4.6: Chromatogram van de extracten van
kalibrator 7 bij 300 nm: het blauwe chromatogram is het
oorspronkelijke, het groene chromatogram is na 24 uur
in de staallader
Piperacilline
Flucloxacilline
IS
(cefoperazone)
Figuur 4.7: Chromatogram van de extracten van kalibrator 7 bij
240 nm: het blauwe chromatogram is het oorspronkelijke, het
groene chromatogram is na 24 uur in de staallader
31
Ceftazidim
Ceftriaxon
Figuur 4.8: Chromatogram van de extracten van kalibrator 7 bij
290 nm: het blauwe chromatogram is het oorspronkelijke, het
groene chromatogram is na 24 uur in de staallader
32
4.1.7 De analytische specificiteit
Bij 300 nm worden in de verschillende plasmastalen componenten gevonden met
ongeveer dezelfde retentietijd als meropenem, maar bij uitvoering van een overlay, wordt
duidelijk dat meropenem later elueert dan de componenten uit de verschillende
plasmastalen (figuur 4.9).
Meropenem
Figuur 4.9: Chromatogram bij 300 nm
In het chromatogram van 240 nm worden kleine pieken opgemerkt met ongeveer
dezelfde retentietijd als de interne standaard en flucloxacilline. Een overlay brengt opnieuw
duidelijkheid. Er kan besloten worden dat er geen interfererende componenten zijn voor
zowel de interne standaard als flucloxacilline (zie figuur 4.10). Bij piperacilline wordt echter
een grote piek opgemerkt met dezelfde retentietijd als piperacilline. Het spectrum van deze
interfererende piek komt overeen met het spectrum van piperacilline. Het plasmastaal bevat
dus piperacilline.
33
Cefoperazone (IS)
Piperacilline
Flucloxacilline
Figuur 4.10: Chromatogram bij 240 nm
Op de golflengte waarbij ceftazidim en ceftriaxon bepaald worden, worden geen
interfererende componenten opgemerkt voor ceftriaxon. Op de retentietijd van ceftazidim
wordt wel een piek waargenomen (figuur 4.11). Wanneer het spectrum van de storende
component bekeken wordt, kan besloten worden dat deze component ceftazidim is. Dus de
patiënt van wie het plasmastaal afkomstig is, krijgt ceftazidim.
34
Ceftriaxon
Ceftazidim
Figuur 4.11: Chromatogram bij 290 nm
4.1.8 Besluit validatie
De geoptimaliseerde methode voldoet aan alle vooropgestelde criteria van de validatie.
Op basis van de stabiliteitsgegevens kunnen richtlijnen opgesteld worden voor de staalname
en de temperatuur bij transport van het staal. Dit laatste is vooral belangrijk wanneer het
staal afkomstig is van externe laboratoria. Om een geïndividualiseerd doseringsschema
(doseringsinterval en toedieningsduur) op te stellen is het nodig om de farmacokinetische
parameters van het toegediende antibioticum te bepalen. Dit kan voortaan door meerdere
bloedstalen tijdens en na infusie van het geneesmiddel bij de patiënt af te nemen. De
concentratie van het antibioticum kan gemeten worden met de geoptimaliseerde methode
zoals beschreven in de volgende casus.
4.2.
ANALYSE VAN PATIËNTSTAAL
Een vrouw, spontaan zwanger van een eeneiige monochoriale diamniotische (MCDA)
tweeling, wordt opgenomen, na 30 weken zwangerschap, op de maternale intensive care
unit met de complicatie twin-to-twin-transfusion syndroom (TTTS). Aangezien de foetussen
een placenta en chorion delen, kunnen de twee foetale circulaties met elkaar verbonden zijn
(figuur 4.12). Meestal is de uitwisseling van bloed tussen beide foetussen in evenwicht, maar
bij TTTS is dat niet zo. TTTS ontstaat wanneer er een verbinding gevormd wordt tussen de
35
slagader van de ene foetus, en de ader van de andere foetus. De balans tussen de
bloedvolumes van de beide foetussen wordt dan verstoord, waardoor de donorfoetus
groeiretardatie vertoont, anemie en uitdroging, terwijl de acceptorfoetus oedeem en
hartfalen vertoont. (41)
Opdat de bevalling zo snel mogelijk zou kunnen worden ingeleid, worden corticosteroïden
toegediend ter bevordering van de longrijping van de beide foetussen. Na 32 weken en vijf
dagen wordt de tweeling uiteindelijk geboren, met behulp van een keizersnede.
Figuur 4.12: Verschillende types tweelingen
(http://accessmedicine.mhmedical.com/ViewLarge.aspx?figid=59796965)
Deze casus handelt over de donorfoetus, J. Bij zijn geboorte weegt J. 1140 gram en is hij
39 cm lang. Ondanks de groeirestrictie door TTTS, doet hij het oorspronkelijk goed. (42)
36
Ten gevolge van herpesletsels, die op dag 25 worden opgemerkt ter hoogte van de
borsten bij de moeder, en omdat het broertje bewezen genitale herpes heeft, wordt J. ook
behandeld met aciclovir. Een PCR reactie wordt bij hem uitgevoerd om na te gaan of hij wel
herpes heeft, maar deze test is negatief.
Op dag 29 heeft J. een opgezet abdomen, gepaard gaande met algemene malaise. Klinisch
en radiologisch komt dit overeen met necrotiserende enterocolitis (NEC). NEC komt het
meest frequent voor bij prematuren. Dit is mogelijk te wijten aan het feit dat bij prematuren
het gastro-intestinaal systeem onvoldoende ontwikkeld is, en daarnaast ook de gastrointestinale motiliteit onvoldoende is. De mortaliteit van NEC is ongeveer 10%. J. wordt
hiervoor behandeld met tritherapie antibiotica (vancomycine, cefotaxime, metronidazol). Na
een week is er echter nog geen verbetering en wordt besloten om hem te opereren. Tijdens
de operatie wordt duidelijk dat er zich vier perforaties bevinden in het colon. Het colon
wordt weggenomen tot het sigmoïd en er wordt een stoma aangelegd. Door deze
perforaties is er veel feces vrijgekomen en is de buik geïnfecteerd geraakt met Enterobacter
cloacae. Enterobacter cloacae is een commensale gram negatieve bacterie die
opportunistisch pathogeen is en een MIC heeft van 2 µg/ml. Deze bacterie wordt behandeld
met meropenem en amikacine. (43)
De dosis meropenem die moet toegediend worden aan J. is moeilijk in te schatten omdat het
enerzijds gaat om een neonaat en anderzijds is hij ernstig ziek. Volgens de literatuur is een
dosis van 20 mg/kg tot 40 mg/kg het meest geschikt en is de T1/2 verlengd ten opzichte van
volwassen personen. In eerste instantie wordt 55 mg IV (± 30 mg/kg) gegeven met een
interval van acht uur en een inlooptijd van 30 minuten. Er worden bloedstalen afgenomen
onmiddellijk na stopzetting van het infuus (T0), na 10 minuten (T10) en na 20 minuten (T20).
De plasmaspiegels worden bepaald en zijn weergegeven in tabel 4.15. (20, 44)
Tabel 4.15: Plasmaspiegel meropenem bij infuus met inlooptijd van 30 minuten en dosis van 55
mg
Tijdstip staalname
Plasmaspiegel meropenem
T0 (stopzetting infuus)
54 µg/ml
T10 (10 min. na infuus)
32 µg/ml
T20 (20 min. na infuus)
28 µg/ml
37
1,8
Log(C) in functie van de tijd
1,7
y = -0,0143x + 1,7042
R² = 0,895
1,6
1,5
Log(C)
(µg/ml)
1,4
1,3
1,2
1,1
1
0
5
10
15
20
25
Tijd (minuten)
Figuur 4.13: Grafiek van de log(C) van meropenem in functie van de tijd bij een dosis
van 55 mg
Uit figuur 4.13 en onderstaande vergelijking kan de halfwaardetijd bepaald worden. De
T1/2 bedraagt 21 minuten.
rico =
−𝑘𝑒
2,303
Halfwaardetijd = 0,693/𝑘𝑒
waarin:
𝑘𝑒 : de eliminatieconstante (min−1 )
Na 6 halfwaardetijden, of ongeveer 2 uur, valt de plasmaconcentratie onder de MIC
waarde (2 µg/ml). Deze veronderstelling is correct wanneer de farmacokinetiek van
meropenem wordt weergegeven via een één-compartimenteel model. Dit is echter niet het
geval, ook in de literatuur wordt beschreven dat de farmacokinetiek van meropenem beter
beschreven wordt met een twee-compartimenteel model. De snelle daling van de
plasmaspiegel kort na stopzetting van het infuus is dus te wijten aan de combinatie van
distributie en eliminatie. De eliminatie T1/2 is dus wellicht een stuk langer. (26)
Omdat J. het geneesmiddel goed blijkt te verdragen, wordt de dosis verhoogd naar 40
mg/kg en de inlooptijd van het infuus wordt verlengd van 30 minuten naar 4 uur. Het
interval tussen twee toedieningen blijft acht uur. Tabel 4.16 en figuur 4.14 tonen de
plasmaconcentraties die hiermee bekomen worden. De eliminatiehalfwaardetijd bedraagt
38
551 minuten, berekend op de gemeten spiegels 30 minuten, 2 uur en 4 uur na stop van het
infuus.
Tabel 4.16: Plasmaspiegel meropenem bij infuus met inlooptijd van 240 minuten en
dosis van 80 mg
Tijdstip staalname
Plasmaspiegel meropenem
T0 (voor start infuus)
15 µg/ml
T120
30 µg/ml
T240 (stopzetting infuus)
36 µg/ml
T270
29 µg/ml
T360
25 µg/ml
T480
22 µg/ml
40
30
C (µg/ml) 20
10
0
0
100
200
300
400
500
600
Tijd (minuten)
Figuur 4.14: Grafiek van de concentratie (C) van meropenem in functie van de tijd bij
een dosis van 80 mg
De plasmaconcentraties die bekomen worden door 40 mg/kg toe te dienen via een infuus
met een inlooptijd van 4 uur zijn dus zeker hoog genoeg om het maximale therapeutische
effect te verkrijgen. Aangezien de T1/2 551 minuten bedraagt en er 80 mg om de 240
minuten wordt toegediend, kan het eventueel nuttig zijn om de dosis opnieuw te verlagen.
39
5.
DISCUSSIE
De resultaten tonen duidelijk aan dat deze methode toepasbaar is voor de kwantitatieve
bepaling van β-lactam antibiotica in humaan serum/plasma. Deze methode is niet de meest
optimale methode voor het bepalen van β-lactam antibiotica, maar sluit goed aan bij andere
analyses die in het laboratorium in routine worden uitgevoerd. Uit literatuuronderzoek blijkt
dat de methode zeer vergelijkbaar is met de reeds beschreven methodes. Dankzij deze
methode is het in de toekomst ook mogelijk om uniforme richtlijnen op te stellen in het AZ
Sint-Jan voor de therapeutisch werkzame plasmaconcentraties van de β-lactam antibiotica.
De methodevalidatie toont aan dat meropenem en flucloxacilline afbraak vertonen
wanneer ze 5 uur bij kamertemperatuur bewaard worden. De beste methode om dus zeker
geen afbraak van de stalen te hebben is om de stalen af te nemen op ijs. Op deze manier
worden ze snel gekoeld, en worden de enzymen onmiddellijk geïnactiveerd.
Deze methode kent een aantal voordelen. Ten eerste bestaat de staalvoorbereiding uit
een eenvoudige methanol precipitatie, waardoor de HPLC-analyse snel gestart kan worden.
De methanol precipitatie vereist ook een laag staalvolume.
Een tweede voordeel is de gelijktijdige scheiding en kwantificatie van de verschillende βlactam antibiotica die vaak gebruikt worden in het AZ Sint-Jan. Ook al is het zeer
onwaarschijnlijk dat een patiënt meerdere β-lactam antibiotica gelijktijdig toegediend krijgt,
op deze manier is het in routine eenvoudiger om verschillende β-lactam antibiotica van
meerdere patiënten gelijktijdig te kwantificeren.
Een nadeel is de relatief lange duur van de analyse, terwijl het bij patiënten met sepsis
net noodzakelijk is om de antibioticumtherapie zo snel mogelijk te optimaliseren. In deze
methode wordt gebruik gemaakt van gradiëntelutie. Nadat de gradiënt doorlopen is, is het
noodzakelijk de kolom te laten equilibreren bij de standaardcondities van de run vooraleer
het volgende staal wordt geïnjecteerd. Alle componenten zijn geëlueerd na 20 minuten maar
de runtijd bedraagt 30 minuten. Naast deze lange runtijd zorgen ook de kalibratoren en
kwaliteitscontroles voor een lange analysetijd. Een mogelijke oplossing hiervoor is dat de
kalibratoren en een kwaliteitscontrole reeds geanalyseerd worden wanneer gemeld wordt
dat er een β-lactam antibioticum dient gekwantificeerd te worden. Wanneer het staal dan
beschikbaar is, is het enkel nodig een tweede kwaliteitscontrole samen met het staal te
analyseren.
40
Een tweede nadeel is dat deze methode naast de vrije plasmaconcentratie, ook de
eiwitgebonden concentratie bepaalt. Voor de meeste onderzochte β-lactam antibiotica is de
eiwitgebonden fractie laag, maar ceftriaxon en flucloxacilline hebben een zeer hoge
proteïnebinding (± 95%). Aangezien enkel de vrije concentratie een therapeutisch effect
heeft, is het dus noodzakelijk de bekomen concentraties te vermenigvuldigen met de vrije
fractie. Bij zwaar zieke personen kan de proteïnebinding echter gewijzigd zijn, het is dan ook
niet correct om de bekomen concentratie zomaar te vermenigvuldigen met de theoretische
vrije fractie.
In toekomstig onderzoek zou het nuttig zijn deze methode te verfijnen naar de bepaling
van de vrije concentratie van de β-lactam antibiotica.
Wanneer er veel patiëntenstalen ter beschikking worden gesteld, zou het ook mogelijk
zijn om farmacokinetische modellen op te stellen van de β-lactam antibiotica. Het
uiteindelijke doel hiervan is om een zogenaamde ‘limited sampling strategy’ toe te passen.
Hierbij zijn slechts twee staalnames in de eliminatiefase nodig van de patiënt om de AUC van
het β-lactam antibioticum te berekenen voor de specifieke patiënt.
41
6.
CONCLUSIE
De methode voor de gelijktijdige kwantitatieve bepaling van de β-lactam antibiotica
meropenem, ceftriaxon, ceftazidim, flucloxacilline en piperacilline is gevalideerd. Als
precipitatiesolvent wordt gebruik gemaakt van methanol, waarna de stalen gedroogd
worden met behulp van stikstof. De chromatografische scheiding gebeurt via gradiëntelutie
met fosfaatbuffer en acetonitrile op een Nucleodur® RP C18 Pyramid kolom (150 mm × 4,6
mm; 5 µm). De methode maakt gebruik van de interne standaard cefoperazone.
De validatie toont aan dat de methode voldoet aan de vooropgestelde criteria voor
reproduceerbaarheid, herhaalbaarheid, juistheid, specificiteit en lineariteit. De LLOQ is
vastgelegd op 2 µg/ml.
De β-lactam antibiotica zijn niet gevoelig aan afbraak wanneer ze vries-dooi cycli
ondergaan of blootgesteld worden aan licht. Na een dag bij kamertemperatuur zijn alle
componenten significant afgebroken, uitgezonderd ceftriaxon. Wanneer de stalen een dag
bewaard worden in de koelkast (6°C) of diepvries (-20°C), breken de bestudeerde β-lactam
antibiotica niet af. Na 24 uur in de staallader, kunnen de extracten nogmaals geanalyseerd
worden, enkel voor meropenem wordt hierbij afbraak vastgesteld. Uit de onderzoeken blijkt
dat de stalen best worden afgenomen op ijs en ingevroren worden tot het moment van de
analyse, om zo een correct resultaat te bekomen.
Aan de hand van een patiëntstaal van een neonaat werd aangetoond dat het zeker nuttig
is om β-lactam antibiotica te kwantificeren bij ernstig zieke patiënten op de intensieve
zorgen. Het is daarbij belangrijk om meerdere bloedafnames uit te voeren op verschillende
tijdstippen tijdens en na toediening van een β-lactam antibioticum. De plasma-concentratietijdscurve kan zo opgesteld worden en hieruit kan de halfwaardetijd van het β-lactam
antibioticum berekend worden alsook de AUC en de tijd dat de plasmaspiegel van het
geneesmiddel de MIC waarde overschrijdt, wat de efficiëntie van de β-lactam
antibioticumtherapie voorspelt.
42
7.
LITERATUURLIJST
1.
Balant-Gorgia EA, Balant LP. Ther. drug monitor. Drugs. 1995;4(6):432-53.
2.
Petty BG. Chapter 11. Principles of Evidence-Based Prescribing. In: McKean SC, Ross JJ,
Dressler DD, Brotman DJ, Ginsberg JS, editors. Principles and Practice of Hospital Medicine.
New York, NY: The McGraw-Hill Companies; 2012.
3.
Taccone FS, Laterre PF, Dugernier T, Spapen H, Delattre I, Wittebole X, et al.
Insufficient β-lactam concentrations in the early phase of severe sepsis and septic shock. Crit.
Care. 2010;14(4):R126.
4.
Roberts JA, Lipman J. Pharmacokinetic issues for antibiotics in the critically ill patient.
Crit. care med. 2009;37(3):840-51; quiz 59.
5.
Pea F. Plasma pharmacokinetics of antimicrobial agents in critically ill patients. Curr.
clin. pharmacol. 2013;8(1):5-12.
6.
Roberts J, Lipman J. Antibacterial Dosing in Intensive Care. Clin Pharmacokinet.
2006;45(8):755-73.
7.
De Paepe P, Belpaire FM, Buylaert WA. Pharmacokinetic and pharmacodynamic
considerations when treating patients with sepsis and septic shock. Clin Pharmacokinet.
2002;41(14):1135-51.
8.
Nguyen HB, Rivers EP, Abrahamian FM, Moran GJ, Abraham E, Trzeciak S, et al.
Severe sepsis and septic shock: review of the literature and emergency department
management guidelines. Ann. Emerg. Med. 2006;48(1):28-54.
9.
Annane D, Bellissant E, Cavaillon J-M. Septic shock. The Lancet. 2005;365(9453):63-78.
10.
Felner K, Smith RL. Chapter 138. Sepsis. In: McKean SC, Ross JJ, Dressler DD, Brotman
DJ, Ginsberg JS, editors. Principles and Practice of Hospital Medicine. New York, NY: The
McGraw-Hill Companies; 2012.
11.
Stearns-Kurosawa DJ, Osuchowski MF, Valentine C, Kurosawa S, Remick DG. The
Pathogenesis of Sepsis. Ann. rev. pathol. 2011;6:19-48.
12.
Chen CL, Cooper MA, Shapiro ML, Angood PB, Makary MA. Patient Safety. In: Billiar
TR, Dunn DL, Hunter JG, Matthews JB, Pollock RE, editors. Schwartz's Principles of Surgery,
10e. New York, NY: McGraw-Hill Education; 2014.
43
13.
Bloch KC. Infectious Diseases. In: Hammer GD, McPhee SJ, editors. Pathophysiology
of Disease: An Introduction to Clinical Medicine, 7e. New York, NY: McGraw-Hill Education;
2013.
14.
Hotchkiss RS, Karl IE. The pathophysiology and treatment of sepsis. N. Engl. J. Med.
2003;348(2):138-50.
15.
Carpenter TC, Czaja AS, Exo J, Grayck EN, Gunville CF, Zebuhr C. Critical Care. In: Hay
WW, Levin MJ, Deterding RR, Abzug MJ, editors. CURRENT Diagnosis & Treatment:
Pediatrics, 22e. New York, NY2013.
16.
Ferris LK, English JC. Chapter 181. The Skin in Infective Endocarditis, Sepsis, Septic
Shock, and Disseminated Intravascular Coagulation. In: Goldsmith LA, Katz SI, Gilchrest BA,
Paller AS, Leffell DJ, Wolff K, editors. Fitzpatrick's Dermatology in General Medicine, 8e. New
York, NY: The McGraw-Hill Companies; 2012.
17.
T. Christiaens GDL, J.M. Maloteaux. Gecommentarieerd Geneesmiddelenrepertorium.
27 ed. Gent: Thierry Christiaens; 2014. 572 p.
18.
Ryan KJ, Ray CG. Antibacterial Agents and Resistance. Sherris Medical Microbiology,
Sixth Edition. New York, NY2014.
19.
Falagas ME, Bliziotis IA. Chapter 185. Fundamentals of Antibiotics. In: McKean SC,
Ross JJ, Dressler DD, Brotman DJ, Ginsberg JS, editors. Principles and Practice of Hospital
Medicine. New York, NY: The McGraw-Hill Companies; 2012.
20.
J.E. de Boer MDB, F. Broekhuijsen, P.K. Cheung, M. Danz, D.R. Dokter, T. Douma, V.
Kloet, M.H.A. van Oppenraay, M.K. Schutte. Farmacotherapeutisch Kompas 2015.
21.
Moon YS, Chung KC, Gill MA. Pharmacokinetics of meropenem in animals, healthy
volunteers, and patients. Clin. Inf. Dis. 1997;24 Suppl 2:S249-55.
22.
Hellinger WC, Brewer NS. Carbapenems and Monobactams: Imipenem, Meropenem,
and Aztreonam. Mayo Clinic Proc. 1999;74(4):420-34.
23.
Leroy A, Leguy F, Borsa F, Spencer GR, Fillastre JP, Humbert G. Pharmacokinetics of
ceftazidime in normal and uremic subjects. Antimicrob. Agents Chemother. 1984;25(5):63842.
24.
Lodise TP, Lomaestro B, Rodvold KA, Danziger LH, Drusano GL. Pharmacodynamic
Profiling of Piperacillin in the Presence of Tazobactam in Patients through the Use of
44
Population Pharmacokinetic Models and Monte Carlo Simulation. Antimicrob. Agents
Chemother. 2004;48(12):4718-24.
25.
Bergan T, Engeset A, Olszewski W, Ostby N, Solberg R. Extravascular penetration of
highly protein-bound flucloxacillin. Antimicrob Agents Chemother. 1986;30(5):729-32.
26.
Wolff F, Deprez G, Seyler L, Taccone F, Hites M, Gulbis B, et al. Rapid quantification of
six β-lactams to optimize dosage regimens in severely septic patients. Talanta.
2013;103:153-60.
27.
Nemutlu E, Kır S, Katlan D, Beksaç MS. Simultaneous multiresponse optimization of
an HPLC method to separate seven cephalosporins in plasma and amniotic fluid: Application
to validation and quantification of cefepime, cefixime and cefoperazone. Talanta.
2009;80(1):117-26.
28.
Denooz R, Charlier C. Simultaneous determination of five β-lactam antibiotics
(cefepim, ceftazidim, cefuroxim, meropenem and piperacillin) in human plasma by highperformance liquid chromatography with ultraviolet detection. J. Chromatogr. B.
2008;864(1–2):161-7.
29.
Ohmori T, Suzuki A, Niwa T, Ushikoshi H, Shirai K, Yoshida S, et al. Simultaneous
determination of eight β-lactam antibiotics in human serum by liquid chromatography–
tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. B. 2011;879(15–16):1038-42.
30.
Samanidou VF, Hapeshi EA, Papadoyannis IN. Rapid and sensitive high-performance
liquid chromatographic determination of four cephalosporin antibiotics in pharmaceuticals
and body fluids. J. Chromatogr. B. 2003;788(1):147-58.
31.
Ikeda K, Ikawa K, Morikawa N, Kameda K, Urakawa N, Ohge H, et al. Quantification of
doripenem in human plasma and peritoneal fluid by high-performance liquid
chromatography with ultraviolet detection. J. Chromatogr. B. 2008;867(1):20-5.
32.
Briscoe SE, McWhinney BC, Lipman J, Roberts JA, Ungerer JP. A method for
determining the free (unbound) concentration of ten beta-lactam antibiotics in human
plasma using high performance liquid chromatography with ultraviolet detection. J.
Chromatogr. B. 2012;907:178-84.
33.
Musson DG, Birk KL, Kitchen CJ, Zhang J, Hsieh JY, Fang W, et al. Assay methodology
for the quantitation of unbound ertapenem, a new carbapenem antibiotic, in human plasma.
J. Chromatogr. B. 2003;783(1):1-9.
45
34.
Pickering M, Brown S. Quantification and validation of HPLC-UV and LC-MS assays for
therapeutic drug monitoring of ertapenem in human plasma. Biomed. Chromatogr.
2013;27(5):568-74.
35.
Legrand T, Chhun S, Rey E, Blanchet B, Zahar J-R, Lanternier F, et al. Simultaneous
determination of three carbapenem antibiotics in plasma by HPLC with ultraviolet detection.
J. Chromatogr. B. 2008;875(2):551-6.
36.
Carlier M, Stove V, Roberts JA, Van de Velde E, De Waele JJ, Verstraete AG.
Quantification of seven β-lactam antibiotics and two β-lactamase inhibitors in human plasma
using a validated UPLC-MS/MS method. Int. J. Antimicrob. Agents. 2012;40(5):416-22.
37.
McWhinney BC, Wallis SC, Hillister T, Roberts JA, Lipman J, Ungerer JPJ. Analysis of 12
beta-lactam antibiotics in human plasma by HPLC with ultraviolet detection. J. Chromatogr.
B. 2010;878(22):2039-43.
38.
Colin P, De Bock L, T'Jollyn H, Boussery K, Van Bocxlaer J. Development and validation
of a fast and uniform approach to quantify beta-lactam antibiotics in human plasma by solid
phase extraction-liquid chromatography-electrospray-tandem mass spectrometry. Talanta.
2013;103:285-93.
39.
Verdier M-C, Tribut O, Tattevin P, Le Tulzo Y, Michelet C, Bentué-Ferrer D.
Simultaneous determination of 12 β-lactam antibiotics in human plasma by highperformance liquid chromatography with UV detection: Application to therapeutic drug
monitoring. Antimicrob. Agents Chemother. 2011;55(10):4873-9.
40.
Yoon K-H, Lee S-Y, Kim W, Park J-S, Kim H-J. Simultaneous determination of
amoxicillin and clavulanic acid in human plasma by HPLC–ESI mass spectrometry. J.
Chromatogr. B. 2004;813(1–2):121-7.
41.
Cunningham FG, Leveno KJ, Bloom SL, Spong CY, Dashe JS, Hoffman BL, et al.
Multifetal Pregnancy. Williams Obstetrics, 24e. New York, NY: McGraw-Hill Education; 2013.
42.
Cunningham FG, Leveno KJ, Bloom SL, Spong CY, Dashe JS, Hoffman BL, et al. Preterm
Labor. Williams Obstetrics, 24e. New York, NY: McGraw-Hill Education; 2013.
43.
Rosenberg AA, Grover T. The Newborn Infant. In: Hay WW, Levin MJ, Deterding RR,
Abzug MJ, editors. CURRENT Diagnosis & Treatment: Pediatrics, 22e. New York, NY2013.
46
44.
van den Anker JN, Pokorna P, Kinzig-Schippers M, Martinkova J, de Groot R, Drusano
G, et al. Meropenem pharmacokinetics in the newborn. Antimicrob. Agents Chemother.
2009;53(9):3871-9.
http://accessmedicine.mhmedical.com/ViewLarge.aspx?figid=59796965 (28/05/2015)
http://cenblog.org/the-haystack/2011/06/front-line-antibiotics-to-fight-e-coli/ (31/03/2015)
http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Ceftazidime.png (31/03/2015)
http://de.wikipedia.org/wiki/Ceftriaxon (31/03/2015)
http://protein.bio.msu.ru/biokhimiya/contents/v75/full/75130303.html (31/03/2015)
http://rissubscontchel.nazuka.net/q.php?n=699-amoxicillin-vor-dem-essen (31/03/2015)
http://www.chemicalbook.com/ChemicalProductProperty_EN_CB4752040.htm (28/05/2015)
http://www.ema.europa.eu/ema/ (28/05/2015)
http://www.pharmawiki.ch/wiki/index.php?wiki=Piperacillin&Spez=True (31/03/2015)
47
LEZING 1: RESEARCH ON THE CAUSES OF HUMAN CANCER AND SCIENTIFIC
STRATEGIES FOR CANCER PREVENTION AND CONTROL
Kanker kan niet beschouwd worden als een ziekte op zich, er bestaan namelijk 200
verschillende soorten kankers. Bij de man komt longkanker het meeste voor, terwijl dit bij de
vrouw borstkanker is. Kanker ontstaat wanneer cellen differentiëren naar kankercellen.
Kankercellen kunnen oneindig veel delen en zich mogelijks ook verspreiden naar andere
delen van het lichaam via het bloed- of lymfvatenstelsel. Wanneer dit gebeurt, spreken we
van metastasen. De wereldwijde mortaliteit door kanker is hoog. 70% van alle sterfgevallen
van kanker kan gesitueerd worden in landen met een gemiddelde tot laag inkomen. Dit komt
voornamelijk door de late diagnose, de onwetendheid over kanker en de nood aan
behandeling ervan, de onmogelijkheid om het te behandelen en het stoppen van de
therapie.
De prevalentie van kanker wordt momenteel geschat op 25 miljoen mensen, maar er
wordt voorspeld dat dit in 2030 zal oplopen tot 75 miljoen mensen. Drie redenen zijn
hiervoor verantwoordelijk, de steeds groeiende en vergrijzende populatie, de ongezonde
levensstijl en de verbetering van de screening naar kanker.
Er zijn twee grote groepen van risicofactoren voor kanker, enerzijds is er de genetische
predispositie, anderzijds zijn er de omgevingsfactoren. Tabakgebruik is de grootste
risicofactor, maar ook Heliobacter pylori, overmatig alcoholgebruik, te weinig groenten en
fruit, hepatitis B en hepatitis C, overgewicht, het human papillomavirus en fysische
inactiviteit zijn niet te negeren risicofactoren.
‘The international Agency for research on Cancer’ (IARC) is gecreëerd door de WHO met
als doel internationale samenwerking te bekomen in kankeronderzoek. IARC focust zich
vooral op ontwikkelingslanden. IARC classificeert stoffen waaraan mensen mogelijks worden
blootgesteld, volgens hun carcinogeen vermogen. Deze stoffen worden beschreven in de
IARC monografieën. Het carcinogeen vermogen wordt uitsluitend berekend via
wetenschappelijke evidentie voor een associatie met kanker. Elke monografie bestaat uit
een kritisch review van de aanwezige wetenschappelijke literatuur en een evaluatie van de
associatie met kanker volgens de wetenschappelijk evidentie.
LEZING 2: RNA THERAPEUTICS: OPPORTUNITIES & CHALLENGES
RNA biedt vele therapeutische mogelijkheden. Voor de translatie van DNA wordt eerst uit
een specifieke DNA-streng enkelstrengig mRNA gevormd. Het mRNA wordt dan omgezet in
proteïnen. Wanneer er echter antisense RNA aanwezig is, kan dit antisense RNA binden op
het mRNA en zo de translatie inhiberen. Niet de gehele mRNA streng is beschikbaar voor
binding met zijn antisense RNA, sommige delen zijn onbereikbaar wegens hun structuur of
aanwezigheid van proteïnen. Een voorbeeld van een geneesmiddel waarvan de werking op
antisense RNA is gebaseerd, is Fomivirsen.
‘Exon skipping’ is een tweede mogelijkheid die beïnvloedt kan worden door therapeutisch
aan te grijpen op het mRNA.
In de afgelopen twintig jaar is er heel wat informatie over RNA interference ontdekt. Deze
informatie is nu zeker nuttig aangezien alle mRNA nu gekend is en het dus mogelijk is om te
kijken welke interfereren. Er zijn ook wel enkele problemen verbonden aan RNA
interference. Ten eerste wordt de molecule snel geklaard, vervolgens kan het ook
intracellullair andere activiteiten gaan uitvoeren en ten slotte is het moeilijk om de molecule
naar de target cel te transporteren. De komende jaren moet dus nog onderzoek uitgevoerd
worden zodat deze RNA therapieën nog doeltreffender worden.
LEZING 3: THE EVOLUTION OF MICROBIOLOGY IN CYSTIC FIBROSIS
Microbiologie kan op veel manieren geïnterpreteerd worden. De meesten denken hierbij aan de
fysiologie van microben en aan de interactie van deze microben met de gastheer. Anderen
beschouwen microbiologie eerder als de detectie en identificatie van microben. Nog anderen denken
eerder aan de diagnose en behandeling van infectieziekten.
Cystische fibrose is de meest voorkomende recessieve genetische stoornis bij de Kaukasiërs. In
Europa hebben ongeveer 60000 mensen cystische fibrose. De oorsprong hiervan is een mutatie in
het CFTR gen. Meer dan 2000 mutaties van dit gen zijn gekend, waaronder 140 die cystische fibrose
veroorzaken.
Cystische fibrose is een multisysteem ziekte. Vooral het gastro-intestinaal systeem en het respiratoir
systeem worden aangetast door deze ziekte. De beschadiging aan het respiratoir systeem is meestal
de doodsoorzaak van deze patiënten en momenteel is de enige oplossing hiervoor een
longtransplantatie. De levensverwachting van deze patiënten is 28 jaar, maar baby’s die nu geboren
worden met deze aandoening zouden gemiddeld 40 jaar worden.